海藻糖對鎘脅迫下水稻幼苗生長的影響

李昉峻，周其文，漆新華，宋正國*

（1.吉林農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，長春 130118；2.農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191）

鎘（Cd）作為一種毒性極強的重金屬，經由水源、食物的攝入可對人體產生致癌作用或引發(fā)慢性疾病[1]。據估算，我國被鎘、砷等污染的耕地近0.12億hm2，僅Cd污染的耕地就高達533萬hm2，點位超標率為7.0%。水稻是對Cd吸收較強的作物之一，也是超過六成國人的主糧。甄燕紅等[2]在2007年對隨機抽取的91種市售大米的檢測中發(fā)現Cd超標率高達10%。采用適當的措施降低介質中（土壤）Cd的有效性，減少水稻根系和籽粒對Cd的吸收累積[3]，不僅能夠保障水稻安全生產，同時也能降低因污染造成的糧食減產等后續(xù)影響帶來的經濟損失。目前的土壤修復技術在解決大面積的農田重金屬污染問題的同時存在某些局限性，例如：成本較高，效率低下，貽誤農時等，因此，抑制重金屬在植物中的轉移和積累是現階段的研究熱點之一[4]。研究表明，施加外源物質如水楊酸、褪黑素、硒、硅、谷胱甘肽、抗壞血酸等可有效緩解植物Cd脅迫[5]。此外，海藻糖（TR）可以保護蛋白質和細胞膜在鹽[6]、干旱[7]和低溫[8]等脅迫情況下引起的失活或變性，顯示出高水平耐受性[9]，但對TR如何影響水稻幼苗Cd吸收的研究鮮有報道。不過Duman等[10]的研究中表明，TR對浮萍（Lemna gibba L.）Cd吸收具有抑制作用，并推測Cd2+可能與TR分子中的羥基發(fā)生絡合反應，從而中斷植物對Cd2+的積累。

TR是由兩個葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構建而成的非還原性二糖，其中雖然有3種可能的海藻糖異構體，但目前只有α，α-海藻糖能從生物體中分離出來并生物合成[11]。這種糖普遍存在于各種各樣的生物中，通常作為能量、碳源、信號分子存在，當它們暴露于各種形式的應激時，會在許多微生物和無脊椎動物中積累[12]。植物自身合成內源性海藻糖的量是有限的[13]，高等植物更是微乎其微，但植物體內普遍都含有海藻糖酶，可能正是為了維持體內TR水平的平衡[14]。如何利用TR良好的抗逆性來應對非生物脅迫已是當前的一個研究熱點，André等[15]通過在煙草植物中過表達TR合成基因提高了對高溫的耐受性。本研究旨在探討TR對Cd脅迫下水稻幼苗生長狀態(tài)的影響，以期為TR影響水稻Cd吸收的生理機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用水稻品種為購買自湖南隆平種業(yè)有限公司的T優(yōu)705，海藻糖由上海源葉生物科技有限公司提供，所有化學品均為分析純試劑級，其純度均超過98%。

1.2 水稻培育

將水稻種子置于5%（V/V）的30%過氧化氫溶液中浸泡10～15 min，用去離子水清洗干凈，均勻鋪在濕潤網格育苗盤上，在恒溫培養(yǎng)箱（28℃，濕度80%）中暗培養(yǎng)48 h進行催芽。待種子胚芽露白后將育苗盤轉移至人工氣候室繼續(xù)培養(yǎng)，當水稻幼苗長至兩葉一心后轉移到含1/10 Hoagland營養(yǎng)液的8 L水培箱中進行培育，待三葉一心時，挑選長勢一致的幼苗饑餓處理2 d后放入不同Cd-TR濃度的處理液，在500 mL PVC黑色罐中進行處理。人工氣候室條件參數：溫度25±3 ℃，光照時長16 h·d-1，空氣濕度60%，光照強度400 μmol·m-2·s-1。

1.3 試驗設計

1.3.1 水稻對Cd2+的時間動力學吸收

設置兩個處理分別為僅Cd處理且濃度為88.96 μmol·L-1（M4）和含26.43 mmol·L-1海藻糖且Cd濃度為88.96 μmol·L-1（M4+T3）的處理，處理時間梯度（h）為：1、2、3、5、7、9、11、14、26、29、32、35、39、48。Cd以CdCl2·2.5H2O的形式加入，每個處理重復3次。

1.3.2 水稻在不同Cd濃度下的吸收動力學

設置 Cd處理濃度：0（M0）、8.89（M1）、17.79（M2）、44.48（M3）、88.96（M4）μmol·L-1，TR 處理濃度：0（T0）、2.64（T1）、13.21（T2）、26.43（T3）、39.64（T4）、52.85（T5）mmol·L-1，其中M0+T0處理為空白對照，即CK，處理時間為18 h。Cd以CdCl2·2.5H2O的形式加入，每個處理重復3次。

1.4 水稻生物量的測定

處理結束后，用5 mmol·L-1氯化鈣溶液浸泡幼苗根系15 min，以除去附著在根系表面的Cd2+，然后用去離子水沖洗干凈。

將水稻幼苗分為莖葉、根系兩部分，迅速稱取其鮮質量，然后裝入信封，置于烘箱中75℃下烘至恒質量。

1.5 鎘、鈣、鎂含量的測定

將已經烘干至恒質量的水稻莖葉和根系剪碎并分別稱取0.20 g于聚四氟乙烯消解管中，加入7 mL硝酸在通風櫥中靜置12 h，用消解儀（ED54，萊伯泰科，美國）加熱至110℃消解2.5 h，待其冷卻后各加入1 mL 30%H2O2繼續(xù)于110℃消解1.5 h，然后升溫于180℃蒸發(fā)溶液至0.5 mL左右。將消解管中剩余液體用去離子水定容至25 mL，用ICP-MS（agilent 7500a，USA）測定樣品中鎘（Cd）、鈣（Ca）、鎂（Mg）的含量。

1.6 葉綠素含量的測定

將新鮮收取的水稻葉片用去離子水沖洗干凈，用濾紙擦干，剪碎后稱取0.2 g用95%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，避光浸提12 h后，以95%乙醇為空白對照，用分光光度計分別在665 nm測定吸光值A665并計算葉綠素a濃度Ca、在649 nm處測定吸光值A649并計算葉綠素b濃度Cb。葉綠素a、b濃度相加即得葉綠素總濃度CT進而求得葉綠素含量（Chl）。

1.7 數據分析

所有數據采用Excel 2007和Origin8.6進行統(tǒng)計分析和作圖，并用SPSS 16.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 TR對Cd脅迫下水稻鮮質量的影響

與試驗期間的CK相比，單獨的TR處理以及單獨的Cd脅迫對植株的鮮質量沒有顯著影響（表1）。相對于CK，M1+T5、M2+T5、M3+T5、M4+T5處理下幼苗莖葉的相對鮮質量分別為88.21%、96.93%、92.94%、98.70%。在所有處理中，根系鮮質量均無明顯變化，應當是由于處理時間較短，對根系生物量未形成明顯影響。與M+T0系列處理的幼苗相比，TR和Cd交互作用的幼苗鮮質量有所下降。在相同Cd處理下，不同濃度TR的施用對水稻鮮質量影響較大，相對于M4+T0而言，M4+T5、M4+T4、M4+T3、M4+T2、M4+T1處理下莖葉鮮質量分別降低了11.6%、6.2%、3.2%、1.1%、3.4%。

2.2 水稻幼苗對Cd2+吸收的時間動力學特征

不同處理下的水稻幼苗Cd含量隨時間的變化如圖1所示，結果表明，M4和M4+T3處理下的水稻幼苗莖葉和根系的Cd含量均隨著時間的延長顯著增加，并呈現出兩個快速吸收期，同時根系Cd含量明顯高于莖葉。當處理時間≤7 h時，兩種處理下水稻莖葉對Cd的吸收差異不大，隨著時間的增加，M4+T3處理的水稻幼苗對Cd的吸收速率明顯低于M4處理的，處理時間為14 h時，M4處理的水稻幼苗莖葉部分Cd含量是M4+T3處理的1.7倍。當處理時間≥14 h時，莖葉中的Cd積累速率進入緩慢增長期，處理時間達到26 h后，莖葉中的Cd積累速率再次躍升。M4+T3處理的水稻幼苗在處理39 h后逐漸趨于平緩，而M4處理的水稻幼苗仍舊快速吸收Cd，在48 h時兩種處理的水稻幼苗Cd含量差值達到最大。此時，M4+T3處理下的水稻葉片Cd含量比M4的降低了42.0%。

表1 不同濃度外源TR及Cd處理后的水稻鮮質量（g·pot-1）Table 1 Fresh weight of rice treated with different concentrations of exogenous trehalose and cadmium（g·pot-1）

水稻根系Cd含量在處理時間≤11 h時呈快速增長趨勢，但兩個處理間無明顯差異。處理時間達到14 h后，M4+T3處理的水稻根系Cd積累趨于飽和，而M4處理的繼續(xù)緩慢增長并于26 h后逐漸穩(wěn)定。與M4處理的幼苗相比，M4+T3處理的水稻幼苗根系在處理48 h時降低了24.2%。

2.3 水稻幼苗對Cd2+吸收的濃度動力學特征

圖1 時間吸收動力學Figure 1 Time absorption kinetics

圖2 濃度吸收動力學Figure 2 Concentration absorption kinetics

TR和Cd交互作用對水稻吸收Cd的影響見圖2，水稻幼苗的Cd積累濃度隨著處理液中Cd濃度的增加而增加，且水稻莖葉和根系對Cd的吸收速率均能良好地擬合米氏方程。根據動力學方程得到水稻幼苗在不同處理下對Cd吸收的最大速率和米氏常數如表2所示，從中可以看出，Cd脅迫下，無TR處理和含TR處理的根系Vmax值差異較小，而莖葉部分Vmax值差異較大。隨著TR濃度的增大，Vmax值逐漸減小。M+T系列處理的莖葉和根系的吸收速率分別比M+T0系列處理的減少了32.44%～41.4%和4.29%～21.56%。Cd脅迫下經TR處理的水稻幼苗在莖葉及根系內的Cd吸收速率均呈現一定程度的下降趨勢，其中以M+T5處理的效果最為明顯。

2.4 TR對Cd脅迫下水稻幼苗Ca、Mg含量的影響

表3數據顯示，M+T0系列處理下的幼苗葉片Ca、Mg含量隨著Cd濃度的增加呈增加趨勢，同時根部Ca、Mg含量逐漸減少。與M1相比，M2、M3、M4處理的水稻莖葉Ca含量分別上升了28.4%、52.8%、17.3%，根系則相應下降了35.9%、49.2%、51.0%。TR顯著提高了相同Cd處理下幼苗葉片的Ca、Mg含量（P＜0.05）（表3）。在M1、M2、M4 Cd處理下，13.21 mmol·L-1海藻糖對葉片Ca含量的增幅最大，分別提高了23.65%、22.97%、10.74%，此時根系Ca含量降低了27.5%、6.9%、11.5%。同時數據表明在M1、M2、M3、M4 Cd處理下，TR對葉片Mg含量的增幅在16.26%～50.91%、2.43%～26.03%、0.16%～6.08%和4.94%～12.16%之間，根系則降低了 22.6%～42.4%、17.2%～55.0%、10.2%～26.6%和3.0%～3.4%。結果表明，在Cd脅迫下TR可有效提高水稻葉片內Ca、Mg含量。

2.5 TR對Cd脅迫下水稻葉綠素含量的影響

在處理期間內，M0+T系列處理的水稻葉綠素含量與CK相比差異不顯著，而M+T0系列處理的幼苗葉綠素含量伴隨著Cd濃度的增加呈下降趨勢（圖3）。此外，Cd脅迫下添加TR處理的幼苗葉綠素含量降低幅度較大，且M+T4處理降幅最大，此時M1+T4、M2+T4、M3+T4、M4+T4處理后的幼苗葉綠素含量與CK相比，分別下降了27.6%、29.9%、36.2%、35.9%。

表2 擬合米氏方程的Cd吸收動力學參數Table 2 Fitted Michaelis Menten kinetics parameters of cadmium uptake

表3 不同濃度外源TR對Cd脅迫下水稻Ca、Mg積累的影響（g·kg-1）Table 3 Effects of various concentrations of TR on Ca and Mg accumulation in rice leaves exposed to Cd（g·kg-1）

3 討論

圖3 海藻糖對葉綠素的影響Figure 3 Effect of trehalose on chlorophyll

植物在極端環(huán)境下會產生并積累TR幫助生存[16]，外源TR的應用也可以改善某些脅迫下部分植物的生長狀況，并且已知TR可以保護植物中蛋白質和膜的結構和功能[17]。而關于對重金屬的耐受性，植物自身也開發(fā)了多種機制來維持和調節(jié)細胞金屬穩(wěn)態(tài)[18]。在本試驗中，增加外源TR的量可減少水稻幼苗Cd的積累。Cd處理后，各幼苗的株高和根長并未發(fā)生顯著變化（未顯示數據），但隨著處理時間的延長，M+T系列處理的幼苗葉片相繼出現不同程度的萎蔫癥狀，基于這些發(fā)現，推測可能是由于M+T系列處理的溶液水勢較低引起。在高滲透壓環(huán)境中，細胞內水分快速流出，同時通過積累滲透物質來增強抗逆性，從而引起細胞脫水[19-20]。Laetitia等[21]在Cd2+對擬南芥水分損失影響的研究中提出Cd脅迫能夠抑制植物根系和葉片的伸長，降低植物鮮質量。如表1所示，本研究中水稻莖葉鮮質量出現不同程度的下降，特別是M4+T5處理下的水稻幼苗表現最為明顯，其在脅迫5 h后，葉片尖端便出現輕微萎蔫，隨著Cd濃度或TR濃度的降低，這種癥狀得到減輕。

李勤鋒等[22]研究發(fā)現紅蛋植物在長時間內對Cd的吸收呈快速吸收和緩慢吸收兩個階段，并提出可能與細胞內外質流速率不同有關。本研究發(fā)現隨著處理時間的延長，水稻幼苗的Cd含量隨之不斷累積（圖2），水稻莖葉Cd吸收存在兩個躍升期，在第一個躍升期Cd的積累速度比較緩慢，可能是由于此時大部分Cd2+被吸附在根系表面，根系是第一個受到Cd影響的器官，其表面具有大量負電荷，作為阻止重金屬進入細胞的第一道屏障，細胞壁通常能吸附大量的Cd2+[23]，少數被轉運進入地上部的Cd2+在莖葉部分積累[24]。短時間刺激下植物可通過增加清除活性氧的酶的表達來降低氧化應激[25]或者誘導膜成分發(fā)生變化來抑制Cd造成的損傷[26]。隨著處理時間的延長，水稻抗氧化水平降低，細胞膜受損，Cd2+迅速得到累積，這可能是出現第二個躍升期的原因。由于TR對膜的保護特性[27]，在添加了TR的Cd溶液中，水稻幼苗對Cd的積累得到明顯的抑制。

目前尚未發(fā)現Cd轉運蛋白，但已有研究表明Cd2+可通過Ca2+、Mg2+等特異性較低通道進入細胞內[28]。圖2顯示Cd脅迫下添加TR處理后水稻的Cd濃度明顯降低，由于Cd2+與植物細胞內的營養(yǎng)元素如鋅、鐵、鈣、錳等具有相似的化學性質，可通過有益金屬元素運輸系統(tǒng)進入根部[29]，大量積累并轉運至地上部分[30]。同時由于它們的相互競爭作用，在脅迫濃度較高或時間過長時，Cd2+的吸收也可能受到抑制[31]。從表3可以看出在M系列處理中幼苗葉片Ca、Mg含量隨著Cd濃度的增加相繼提高，同時根系Ca、Mg含量下降。Peel等[32]提出當競爭性離子的濃度越高，管壁上負電荷位點的陽離子越容易被交換下來，促進其向上運輸。另外，木質部中養(yǎng)分是從地下運往地上的單向運輸，且Ca2+在韌皮部中難以移動，所以水稻中幼苗的Ca2+會出現隨著脅迫程度的增強，Ca、Mg大幅度的從根系轉移至莖葉部位的現象。表3中數據顯示，TR的添加使得Cd脅迫下的幼苗葉片在有效降低Cd積累的同時提高了Ca、Mg含量。有研究發(fā)現外源施加的TR通過氫鍵和磷酸基團來穩(wěn)定生物膜[33]，所以推測由于TR對膜的穩(wěn)定性，增強了Ca2+、Mg2+同Cd2+的競爭能力，有效地保護了有益元素轉運通道，從而減少了轉運蛋白對Cd的轉運，降低了植物內Cd的含量，且可能通過增加Ca2+、Mg2+在木質部中的移動性來提高葉片內的Ca、Mg含量。

Bazzaz等[34]研究認為，隨著Cd脅迫濃度的增加，植物葉綠素含量呈下降趨勢。由于根系是植物吸收水分的一個重要部位，根系的損傷也將對植物吸水造成不利影響，并且在脅迫條件下，隨著植物的抗逆性增強，細胞自由水的相對量也可能減少。隨著Cd處理濃度的增加水稻幼苗葉綠素含量逐漸下降，試驗結果與Stobart等[35]研究結果相一致。在Cd溶液中，同時添加了TR處理后水稻葉綠素含量明顯下降可能是由于植物缺水從而抑制了葉綠素的合成，甚至導致原有葉綠素的分解。

4 結論

（1）隨著處理時間的延長，水稻莖葉部分的Cd積累量出現兩個躍升期，并且TR+Cd處理的幼苗莖葉部分和根系部分的Cd積累都得到了有效抑制。

（2）TR可以有效緩解Cd對水稻幼苗的脅迫作用，并且在相同Cd濃度下，隨著TR濃度的升高，Cd積累量降低，同時，Ca、Mg含量有所提升。

（3）在相同Cd濃度處理下，TR的添加引起水稻葉綠素減少，光合作用的降低，會導致水稻幼苗生物量降低。