酶的制備與分析

姜聯合 編譯

（中國科學院植物研究所 北京 100093）

酶類是所有生物體自然產生的一種蛋白質。作為催化劑，它們能將大的復雜的結合物分解為較小的因子，從而在機體中更易被利用。同樣，大量的復合物需要小分子酶類來分解。日常所知的洗衣液、胰島素等都是酶類的一種，食品、藥品、化妝品都有酶的影子。酶是怎樣產生的？又有哪些類別，都應用在何處？一起來制作一個生物反應器，學習檢測分析酶類的方法。

1 背景知識

根據酶類分解的物質對酶進行分類。例如，纖維素酶能將纖維素分解為單糖；蛋白酶是一種能將明膠這類物質分解的酶類；過氧化氫酶能分解過氧化氫：H2O2→2H2O+O2。

當處于合適的溫度和pH值時，酶類才具有活性。可根據這些特點考慮酶類是否能運用在商業中。商業上使用的酶類都是從生物反應器中的細菌和真菌體內分離得到的。

生物反應器是能繁殖大量微生物、生產所需產物的大容器。所需產物可以是醫藥行業所需的蛋白質，例如糖尿病患者所需的胰島素；也可以是工業上所需要，用于軟化紙張、制作奶酪，或者是讓藍色牛仔服褪色；也可能是家庭所需的如用于軟化肉類的蛋白質酶和洗衣液。生物反應器必須包括以下條件：首先，必須能被完全滅菌；其次，能提供一個微生物繁殖并產生大量代謝產物的環境；有一個進氣口、一個排氣口、一個加樣口，以及一個安置測量電極的路徑。影響生物反應器效率的因素包括：培養物的純度、使用的介質、溫度、pH值、溶氧量和二氧化碳含量。

2 實驗目的

1）描述能影響微生物生長和代謝產物成分的因子；

2）掌握檢測現有酶類的方法。

3 裝備生物反應

3.1 實驗材料 衛生紙、5 L 10%消毒液、5 L桶；1.25 L飲料瓶（空的且潔凈）、玻璃棒或鈍探針、酒精燈、1 m潔凈的水管、氣石、鋒利的剪刀或刀片、硅膠塞、15 L無菌水、橡皮圈、大紙夾鑷子、燒杯、液體酒精、裝在密封瓶子里的消毒棉（用鋁箔紙封口，在160℃烘箱中滅菌2 h）、空氣泵。

3.2 實驗步驟

1）用衛生紙蘸取稀釋的消毒劑，擦拭實驗臺；

2）用酒精燈加熱鈍探針或玻璃棒的一端，在飲料瓶的上端打3個等距的孔，每個孔將安裝干凈的水管；

3）用剪刀或刀片將水管切成以下長度：排氣管12 cm、上樣管30 cm、充氣管50 cm；

4）將每個水管插到對應的孔中（圖1）：排氣管應將一半以上插入瓶中，上樣管應插入到接近卻不碰到瓶底，充氣管應該接觸到瓶底；

圖1

5）將接通空氣的管子與充氣管的末端接在一起；

6）用硅膠塞將管口密封，可用橡膠圈將管子固定；放置 24～48 h；

7）帶上手套；

8）用衛生紙蘸取稀釋的消毒劑，擦拭實驗臺；

9）在燒杯中加入液體酒精，并將鑷子浸沒其中；

10）將桶里加入10%消毒液，將瓶子和瓶蓋浸沒在其中至少10 min；

11）倒掉消毒液；

12）用冷的無菌水沖洗3次；

13）蓋上瓶蓋，用夾子夾住折過來的上樣管達到密封效果；

14）用滅菌的鑷子將消毒棉輕輕塞入進排氣管和充氣管的末端，并將充氣管與空氣泵連接。

4 生物反應器接種

4.1 實驗材料 天平、2個稱量盤、15 g糖、1 g酵母膏、350 mL蒸餾水、加熱板、400 mL帶塞子的錐形瓶、漏斗、1 L 10%消毒液、3 L無菌水；pH試紙或者 pH 計、0.1 mol／L HCl、1 袋（7 g）活性酵母（釀酒酵母）。

4.2 實驗步驟

15）用衛生紙蘸取稀釋的消毒劑，擦拭實驗臺；

16）將350 mL蒸餾水加入錐形瓶；

17）用天平稱取糖與酵母膏；

18）將糖和酵母膏加入錐形瓶并加熱至沸騰；

19）測量溶液的pH值，如果高于5.4，就慢慢加入鹽酸讓pH值降至5.4；

20）煮沸15 min，然后蓋上蓋子，冷卻；

21）用桶中稀釋的消毒液將漏斗消毒，然后用無菌水清洗3次；

22）快速打開瓶蓋，將漏斗插入，將肉湯灌入生物反應器；

23）蓋上蓋子并開始充氣，這便能產生一個正壓，使得其他的微生物很難進入；

24）再次將蓋子打開，插入漏斗，并加入一袋酵母粉；

25）將蓋子蓋緊。

5 分析酶的產量

5.1 實驗材料 10 mL注射器、消毒棉、3% 過氧化氫液、移液管、帶蓋子的瓶子（比微量離心管大的）、2個顯微鏡載玻片、1個蓋玻片、微量離心管、秒表或計時器、在培養皿中倒入5 mm厚的含有紅色食用色素的明膠、滴管、2根試管、試管架、將0.33 g肉類軟化劑溶解在10 mL水中、透射光學顯微鏡（物鏡放大倍數為40倍）、100 mL 10%消毒液、100 mL量筒。

5.2 實驗步驟 分析從接種的當天及其后3 d分別進行。必須每天攪拌樣品數次。

26）打開上樣管的夾子，接上10 mL注射器并抽取大約3 mL發酵液棄去；

27）抽取10 mL發酵液。夾上夾子，取下注射器并塞上消毒棉。

6 過氧化氫酶分析

28）向微量離心管中加入0.5 mL發酵液；

29）加入0.5 mL 3%的過氧化氫溶液；

30）立刻蓋上離心管的蓋子然后置于一個帶有蓋子的容器中；

31）如果產生大量的氣泡，則說明含有過氧化氫酶；

32）記錄下從開始到產氣量達到最高的時間，如果超過半小時即可停止分析；

33）將用過的離心管放入裝有消毒液的桶中。

7 蛋白酶分析

34）用吸管從含有明膠的培養皿中取適量明膠放入一根試管中；

35）重復上述操作，將明膠放入第2根試管；

36）在第1根試管中加入1 mL發酵液；

37）在第2根試管中加入1 mL肉湯；

38）記錄溶解明膠塊所需的時間；

39）將用過的試管放在裝有消毒液的桶中。

8 顯微鏡觀察

40）在載玻片上滴1～2滴培養物，蓋上蓋玻片；

41）將用過的注射器放入裝有消毒液的桶中；

42）調節透射顯微鏡至低倍鏡；

43）將載玻片放在顯微鏡載物臺上，畫下并標記出所觀察到的；

44）調節顯微鏡至高倍鏡，畫下并標記出所觀察到的；

45）將用過的玻片放在裝有消毒液的桶中。

9 思考題

1）微生物在需氧的液體環境中生長需要哪些必要的條件？（提供氧氣和攪拌。）

2）為什么在厭氧環境微生物不能產生酶類？（酶的產生是依賴ATP的合成代謝途徑，而氧氣形成是合成酶所需ATP的前提。）

3）舉例說明微生物產生的酶類和蛋白質在工業上的應用。（答案不唯一，在背景知識中提到過。）

10 現實生活中生物反應器的應用

生產酶類：酶類被廣泛用于食品行業、制造業、制藥業和家庭使用的化學物品中。