重組牛乳鐵蛋白肽衍生肽設計及其在畢赤酵母中的表達

呂自力，張恩鵬，郭愛珍，羅斌，梁鑫，單旭東，莊靜，張霞，王亮

1(成都中醫藥大學 醫學與生命科學學院，四川 成都,610041) 2(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江,212013)

乳鐵蛋白是一種由哺乳動物黏膜上皮細胞分泌產生的分子質量為80 kDa的糖基化蛋白，在不同物種間具有高度的同源性[1]。乳鐵蛋白也是轉鐵蛋白家族的一員，對鐵離子具有高度的親和性，被認為是人類和哺乳動物防御系統的基本組成之一[2]。乳鐵蛋白肽是乳鐵蛋白在酸性條件下經胃蛋白酶消化得到的一種短肽，具有良好的耐熱性、非抗原性、免疫調節活性和廣譜抗菌、抗病毒等生物活性[3-5]，目前，已在鼠、山羊、牛、駱駝等動物和人體內發現。研究表明，牛乳鐵蛋白肽的抗菌活性更高[6]。

牛乳鐵蛋白肽是從牛乳鐵蛋白N端獲得的長度為25個氨基酸殘基的短肽(N17-41: FKCRR WQWRM KKLGA PSITC VRRAF)，分子質量為3 126.4 Da，相對疏水性為48%，電荷數為+8，在牛乳鐵蛋白分子中呈α-螺旋結構，當從牛乳鐵蛋白分子上釋放出來后，在水分子及鹽離子的作用下，α-螺旋消失，轉換為兩親性反向β-折疊結構[7]，即親水性基團和疏水性基團，分別排列在β-折疊兩側，這種結構上的變化使牛乳鐵蛋白肽具有比牛乳鐵蛋白更高的抗菌活性[8]。有研究表明，在發揮抑菌作用時，兩親性結構有利于促進牛乳鐵蛋白肽與細菌細胞膜脂多糖的結合，帶正電荷的氨基酸殘基與帶負電的磷脂發生靜電相互作用，導致細胞膜穿孔，細胞內容物泄漏[9]。不同于傳統抗生素的抑菌機制，牛乳鐵蛋白新型抑菌機制有利于其作為抗生素替代藥物的研發和應用。由于天然來源有限且制備工藝復雜，因此利用基因工程技術生產牛乳鐵蛋白肽已成為一個趨勢。

近年來，研究人員致力于抗菌肽結構-功能關系的研究，期望通過對抗菌肽兩親性參數，凈電荷數，疏水性參數的改變獲得具有更高生物活性的衍生肽[10]。EDWARDS等[11]通過對6種β-發卡型抗菌肽的研究發現，隨著兩親性的增加，其抗菌活性也逐漸增加。作為一種兩親性陽離子活性肽，牛乳鐵蛋白肽的活性與其兩親性密切相關。在形成β-折疊時，Phe1，Cys3，Trp6，Trp8，Leu13，Ala15，Pro16，Ile18和Cys20構成疏水表面，這對于其發揮抗菌功能是十分重要的[12]。STR?M等[13]對15個殘基的牛乳鐵蛋白肽進行了丙氨酸掃描實驗，結果表明Trp6和Trp8是保持其活性的關鍵氨基酸，當將人乳鐵蛋白肽(LfcinH)第8位Arg替換為Trp后，其抗菌活性明顯提高。LEJON等[14]對牛乳鐵蛋白肽進行了色氨酸替換研究，W3,14和W14都顯示出比母肽更強的抗菌活性，可以看出3、4、10、14等為潛在的替換位點。牛乳鐵蛋白肽作用機制和結構功能關系的研究有利于設計得到高活性的衍生肽。

在本研究中，基于抗菌肽的結構和功能之間的關系，利用抗菌肽數據庫和生物信息學分析工具設計了LfcinB-W4,10[15-16]。經過一系列的比較分析，牛乳鐵蛋白肽第4位Arg和第10位Met被Trp替換后能夠保持與母肽相似的空間結構，其正電荷數為+7，相較母肽有所降低，疏水殘基比例提高到52%。通過抗菌肽數據庫預測其抗菌活性優于母肽。將優化的LfcinB-W4,10基因插入分泌型表達載體pPIC9K中，線性化后電轉入巴斯德畢赤酵母GS115中，誘導表達后發現發酵上清液具有較強的抗菌活性。實驗研究為分析和優化牛乳鐵蛋白肽的抗菌活性提供了理論基礎。

1 儀器與試劑

Gene-Pluser XcellTM電轉儀，美國伯樂公司； 1645050型DNA電泳儀，美國伯樂公司；Eppendorf 5418R型高速離心機，德國Eppendorf股份公司；SW-CJ系列超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；QY200型恒溫搖床，上海福馬實驗設備有限公司；LSHZ-300系列恒溫水與培養箱，太倉市強樂實驗設備有限公司；BPMJ-250F系列霉菌培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。大腸桿菌(Eschenchiacoli)DH5α和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923，為本實驗室保藏；巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115及表達質粒pPIC9K，Invitrogen公司；遺傳霉素G418，賽默飛世爾科技有限公司；限制性核酸內切酶EcoRI，NotI，SacI和T4 DNA連接酶，Invitrogen公司；PCR引物和LfcinB-W4,10基因序列，由上海生工生物工程有限公司合成；基因組提取試劑盒，Qiagen公司。其他試劑均為分析純。

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，固體培養基加入瓊脂粉20；YPD培養基(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，固體培養基加入瓊脂粉20；MD培養基(g/L)：葡萄糖20，無氨基酵母氮源13.4，生物素10-4，瓊脂粉20；MM培養基：甲醇50 mL/L，無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素10-4g/L，瓊脂粉20 g/L；BMGY培養基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素10-4g/L，甘油100 mL/L；BMMY培養基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素10-4g/L，甲醇25 mL/L。

2 方法與結果

2.1 LfcinB-W4,10的基因設計與合成

使用抗菌肽數據庫APD(http://ap s.unmc.edu/AP/)[17]和ExPASy(http://we b.expasy.org/protparam)的預測工具對比分析牛乳鐵蛋白肽和LfcinB-W4,10的物理和化學參數，包括凈電荷、疏水殘基的比例、分子質量、理論等電點、脂肪族指數和GRAVY(親水性的平均值，親水指數)，結果如表1所示。相較于牛乳鐵蛋白肽，LfcinB-W4,10的疏水殘基由48%提升至52%，由于Arg的替換，其凈電荷數由+8降低至+7，這可能有利于在表達過程中降低宿主蛋白酶對目的蛋白的降解。利用同源建模工具SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)[18]模擬牛乳鐵蛋白肽和LfcinB-W4,10的空間結構，結果如圖1所示，LfcinB-W4,10具有和牛乳鐵蛋白肽相似的二級折疊結構，這使得LfcinB-W4,10依然具備和牛乳鐵蛋白肽類似的生物學功能；通過抗菌肽數據庫APD和CAMP(http://www.cam p.bicni rrh.res.in/index.php#)[19]的預測工具預測LfcinB-W4,10的抗菌活性，如表2所示，結果顯示，LfcinB-W4,10的各項預測數據都高于牛乳鐵蛋白肽，表明LfcinB-W4,10的設計在理論上具有可行性，為實驗研究奠定了基礎。根據畢赤酵母密碼子偏好性優化得到基因序列，在序列兩端添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(圖2)，交由生工生物工程有限公司合成。

表1 牛乳鐵蛋白肽及LfcinB-W4,10理化參數分析

注： GRAVY，Grand average of hydropathicity，親水性指數。

圖1 牛乳鐵蛋白肽和LfcinB-W4,10空間結構對比

Fig.1 Spatial structure comparison of LfcinB and LfcinB-W4,10

表2 LfcinB及LfcinB-W4,10抗菌活性預測

Table 2 The antimicrobial activity prediction of LfcinB and LfcinB-W4,10

蛋白肽SVMRFDAANNCAMP預測LfcinB0.8420.99450.963AMPAMPLfcinB-W4,100.9580.9950.974AMPAMP

2.2 重組表達載體構建

使用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切含有目的基因的擴增質粒pUC-SP-LFcinB-W4,10，經2.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)，檢測到82 bp的條帶，與目的基因大小一致，目的基因回收后與同樣經EcoRⅠ 和NotⅠ 雙酶切的外泌型表達質粒pPIC9K使用

圖2 LfcinB-W4,10的基因序列

Fig.2 The gene sequence of LfcinB-W4,10

注：TGG、Trp表示酶切位點

M-DNAmarker；1-目的基因LfcinB-W4,10；2-pUC-SP-LfcinB-W4,10

圖3 pUC-SP-LfcinB-W4,10雙酶切電泳

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of pUC-SP-LfcinB-W4,10

T4 DNA連接酶進行連接，構建得到表達載體pPIC9K-LFcinB-W4,10(圖4)。圖4將構建好的表達載體轉化感受態大腸桿菌DH5α進行擴增，擴增后的表達載體進行雙酶切鑒定，根據重組質粒和空載質粒的序列分析，當使用AvrⅡ和NdeI進行雙酶切鑒定時，空載質粒被切成5 881 bp和3 395 bp的2條DNA電泳條帶，而重組質粒由于缺失了AvrⅡ酶切位點只能夠被線性化，電泳時表現為1條條帶(圖5)，結果與預期相符，說明重組質粒構建成功。

圖4 重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W4,10構建

Fig.4 Construction of recombinant expression vector pPIC9K-LFcinB-W4,10

M-DNAmarker 1-pPIC9K-LfcinB-W4,10；2-pPIC9K

圖5 pPIC9K-LFcinB-W4,10雙酶切鑒定

Fig.5 Dual-Enzyme Digestion of pPIC9K-LFcinB-W4,10

2.3 重組表達載體轉化畢赤酵母

根據畢赤酵母表達手冊所述方法制備感受態畢赤酵母GS115，將已鑒定的陽性重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W4,10經SacI酶切線性化后電轉化畢赤酵母[20]，將菌液涂布于MD培養基，30 ℃培養2～3 d直至轉化子長出。

2.4 高拷貝轉化子的篩選及甲醇利用型鑒定

將上一步獲得的pPIC9K-LfcinB-W4,10-GS115轉化子涂布于含有漸增濃度(0.5～4.0 mg/mL)G418的YPD瓊脂平板，30 ℃培養2～3 d篩選得到高拷貝轉化子。根據拷貝數和G418質量濃度的關系[21]，在G418質量濃度為2 mg/mL的YPD平板上得到拷貝數約為8的轉化子。

使用無菌牙簽挑取拷貝數為8的轉化子，分別點接種至MM和MD平板，30 ℃培養2～3 d待轉化子長出。MM培養基中，甲醇為唯一碳源，MD平板中葡萄糖為唯一碳源。甲醇利用型為Mut+的轉化子在2種平板上能夠正常生長，甲醇利用型為Muts的轉化子在MD平板上正常生長，在MM平板上生長緩慢。根據生長速度的快慢，可確定轉化子的甲醇利用型。

2.5 高拷貝轉化子PCR鑒定

挑取10個轉化子提取酵母基因組DNA并且進行PCR擴增，擴增引物為5′AOX Ⅰ：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′與3′AOXⅠ：GCAAATG GCACTG ACATCC-3′。實驗設置雙蒸水作為空白對照，未轉化質粒的酵母基因組為陰性對照。PCR產物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖6所示, 3號為假陽性轉化子，4～12號為陽性轉化子，在562 bp處出現含有目的基因的擴增條帶，其中，4～9,11，12號轉化子在2.2 k出現甲醇脫氫酶AOX I基因的條帶，其甲醇利用型為Mut+，10號在2.2 k處未出現條帶，其甲醇利用型為Muts。結果證明，9個轉化子成功整合目的基因。

1-空白對照；2-陰性對照；3～12-轉化子基因組PCR

圖6 轉化子PCR鑒定

Fig.6 Identification by PCR of transformants genome

2.6 LfcinB-W4,10的誘導表達

挑取經PCR鑒定為陽性克隆的重組酵母轉化子單克隆接入5 mL BMGY培養基，30 ℃，200 r/min培養24 h，隨后接入100 mL BMGY培養基培養20 h至OD600為2～6。然后4 100 r/min離心5 min收集菌體，于250 mL三角瓶中用100 mL BMMY培養基重懸菌體，30 ℃，200 r/min振蕩誘導培養，每隔24 h取樣1 mL用于檢測其抑菌活性并補充甲醇，使甲醇終濃度占體積分數2.5%。

2.7 抑菌活性檢測

采用抑菌圈法檢測LfcinB-W4,10的抑菌活性，將100 μL過夜培養的金黃色葡萄球菌菌液加入20 mL LB培養基中混勻，倒入已滅菌的培養皿中。待凝固后用已滅菌的打孔器打孔，每孔加入80 μL發酵上清液，以40 μL氨芐青霉素溶液(100 mg/mL)作為陽性對照，以未轉化的酵母發酵上清液為陰性對照，于37 ℃培養16 h，檢測其抑菌活性。結果如圖7所示，圖中7-A為40 μL 100 mg/mL的氨芐青霉素作為陽性對照，孔6為 80 μL未轉化重組表達載體的畢赤酵母GS115在相同誘導條件下的發酵上清液作為陰性對照。隨著發酵時間的增加，發酵上清液產生的抑菌圈逐漸增大(圖8)，但是當發酵時間超過96 h后，抑菌效果有所降低，這可能是因為宿主蛋白酶使目的蛋白發生了降解。

1-24 h發酵上清液； 2-48 h發酵上清液； 3-72 h發酵上清液；4-96 h發酵上清液； 5-120 h發酵上清液；6-未轉化目的基因的畢赤酵母GS115發酵上清液；A-陽性對照

圖7 發酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

Fig.7 Antibacterial activity of fermentation broth against Staphylococcus aureus

圖8 不同誘導時間抑菌圈直徑

Fig.8 The diameter of the inhibition zone in different time

把對照的原生肽LFcinB與衍生肽LFcinB-W4,10采用抑菌圈法檢測，如圖9所示，孔1和孔3為原生肽LfcinB，分別加入40 μL和80μL發酵上清液。孔2和孔4為衍生肽LfcinB-W4,10，也分別加入40 μL和80 μL發酵上清液。以40 μL氨芐青霉素溶液(100 mg/mL)作為陽性對照，于37 ℃培養16 h，檢測其抑菌活性。結果顯示，衍生肽的抗菌活性要優于原生肽抗菌活性。

孔1～4的抑菌圈直徑分別為15、18、23和25 cm

圖9 LFcinB與LFcinB-W4,10的抑菌活性比較

Fig.9 Compared antibacterial activity between LFcinB and LFcinB-W4,10

2.8 Tricine-SDS-PAGE鑒定

根據抑菌活性檢測結果，在誘導培養第96小時，收集發酵上清液，使用18%含6 mol/L尿素的分離膠Tricine-SDS-PAGE分析，結果如圖10所示，轉化子組在3.2 kDa處有1條明顯的條帶，與實驗設計的LfcinB-W4,10氨基酸殘基的短肽相對分子質量一致。而空菌在相同條件下的發酵上清液沒有條帶，表明LfcinB-W4,10在畢赤酵母中有效分泌表達。

M-蛋白marker；1-空菌；2-轉化子

圖10 Tricine-SDS-PAGE檢測

Fig.10 The detection of LfcinB-W4,10 by Tricine-SDS-PAGE

3 討論

實驗在綜合分析其他實驗研究的基礎上，對LfcinB基因進行了多位點突變，旨在探究氨基酸殘基的改變對其抗菌活性的影響，對衍生肽和原肽進行理化性質、空間結構、抑菌活性的分析，為獲得更高活性的衍生肽奠定了基礎。根據畢赤酵母分泌型穿梭表達質粒pPIC9K的多克隆位點，在目的基因兩側添加了EcoRI和NotI的限制性酶切位點，將合成的LfcinB-W4,10基因克隆至表達載體，經SacI線性化后電轉至畢赤酵母宿主菌GS115中，經篩選得到G418高抗性陽性轉化子，提取酵母基因組進行PCR鑒定，獲得9株整合成功的陽性轉化子且甲醇利用型8株為Mut+，1株為Muts。經甲醇誘導后對其抗菌活性進行分析發現，有1株菌蛋白表達較快，抑菌效果較好，另外8株在誘導72 h后也表現出較強的抑菌活性。誘導表達96 h后，其抑菌活性有所下降，這可能是因為宿主蛋白酶降解異源蛋白造成的[22-23]。在進一步的實驗中，將對培養溫度，甲醇誘導濃度等條件進行優化以期獲得大量LfcinB-W4,10。

抗菌肽由于其抗菌原理不同于傳統抗生素，不具有傳統抗生素所具有的抗藥性，這有利于其作為抗生素替代藥物的研發和應用。天然存在的乳鐵蛋白，來源有限且制備工藝復雜，抗菌活性低，因此利用基因工程技術生乳鐵蛋白肽已成為一個趨勢。本文從生物信息學分析工具開始，基于抗菌肽結構和功能的關系設計了LfcinB衍生肽LfcinB-W4,10，實驗結果表明，抗菌肽LfcinB-W4,10基因已正確整合到酵母基因組，并且獲得表達，衍生肽具有良好的抑菌活性，而酵母發酵可以大規模生產目的蛋白，兩者結合，為大規模工廠化生產抗菌肽奠定了良好的基礎。