兩株魏斯氏菌的益生特性比較

李文，陳銀元，陳立明，郭祥，袁珍虎，王陶*

1(徐州工程學院，江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州，221008) 2(徐州正昌飼料有限公司，江蘇 徐州，221008)

益生菌是一種能夠黏附在宿主體內來增強宿主免疫能力，或通過促進宿主腸道的營養組成與控制體內多種菌的動態平衡，來提高宿主健康程度的活性微生物[1]。常見的益生菌有枯草桿菌、乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌等。用于發酵的益生菌多以乳酸菌為主，其作為食品發酵劑已有很長使用歷史，被普遍認為安全性較高[2-3]，具有多種生理功能，如控制腸道內穩態、免疫調節、抑制病原菌、抗過敏、抗腫瘤、延緩衰老等[4-7]。乳酸菌若想順利到達體內并發揮作用，一方面，要具備對胃腸道內酸和膽鹽的耐受能力[8]；另一方面，要能夠黏附于宿主的腸壁細胞，以保證其能抵抗住腸道的蠕動作用[9]；此外，還必須具備對常見致病菌的抑制能力以及對膽固醇和甘油三酯的降解能力等[10]。目前對于乳酸菌益生特性的研究，多集中于植物乳桿菌、發酵乳桿菌、戊糖乳桿菌等[11-13]，鮮有魏斯氏菌益生特性的報道，而不同益生菌株在益生特性方面存在著高度的特異性[14]。

魏斯氏菌屬于乳酸菌，廣泛分布于發酵食物如臘腸、泡菜、醬油、豆豉等, 多數菌種在食品發酵過程中起重要作用，對食品中酯類、有機酸及短鏈脂肪酸等風味物質的合成具有重要作用。此外，其還具有合成細菌素、胞外多糖等特性，具有潛在的益生菌特性[15]。因此，本研究以分離自泡菜的2株魏斯氏菌——希臘魏斯菌(WeissellaHellenica)WS-419和綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)ZY-6為對象，對其益生特性如耐酸性、耐膽鹽、腸液耐受性、抑菌特性、降解膽固醇和甘油三酯、表面特性進行比較研究，為進一步應用此2株菌進行功能性食品的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 材料與試劑

希臘魏斯菌(WeissellaHellenica)WS-419、綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)ZY-6、沙門氏菌(Salmonella)SM-5、大腸桿菌(Escherichiacoli)EC-19、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)SA-405，徐州工程學院微生物遺傳育種實驗室保存。

甘油三酯、膽固醇測定試劑盒，長春匯力生物技術有限公司。

膽固醇、豬膽鹽、檸檬酸銨、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、葡萄糖、無水乙酸鈉、吐溫-80、正己烷、蔗糖酯等均為國產分析純。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 LB液體培養基(g/L)

酵母浸膏5，胰蛋白胨10， NaCl 10，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 LB固體培養基

LB液體培養基中加入15 g/L的瓊脂粉。

1.1.2.3 LB半固體培養基

LB液體培養基中加入7.5 g/L的瓊脂粉。

1.1.2.4 MRS液體培養基(g/L)

葡萄糖20、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏15、檸檬酸銨2、無水乙酸鈉5、MnSO4·H2O 0.198 g/L、K2HPO4·3H2O 2.62、MgSO4·7H2O 0.58、吐溫-80體積分數0.1%，pH 6.0～6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.5 MRS固體培養基

MRS液體培養基中加入15 g/L的瓊脂粉。

1.1.2.6 甘油三酯(TG)培養基

MRS培養基中加入體積分數1%的豬油和體積分數5%的吐溫-80、質量濃度2 g/L巰基乙酸鈉， pH值6.0，121 ℃滅菌15 min。

1.1.2.7 膽固醇(TC)培養基

MRS培養基中加入質量濃度0.1 g/L膽固醇、體積分數0.5%冰乙酸、體積分數0.1%吐溫-80、質量濃度2 g/L巰基乙酸鈉、質量濃度0.1 g/L蔗糖酯， pH 6.0，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 主要儀器設備

HYG-Ⅱ回旋式恒溫調速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設備有限公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；SW-CJ-IF超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；FA2104N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；64RL高速冷凍離心機，美國Beckman公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；酶標儀SynergyHI ，美國Biotek 公司；722型分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備

將保藏于甘油管的希臘魏斯菌WS-419和綠色魏斯菌ZY-6接種于MRS液體培養基，37 ℃靜置培養24 h，再以4%的接種量接種至新鮮MRS液體培養基，37 ℃靜置培養16～18 h至對數生長期，得種子液。

1.2.2 耐酸性測定

將2株魏斯菌種子液按4%的接種量接入pH值分別為2、3、4的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養，分別于0、1、2和3 h從中吸取菌懸液，進行梯度稀釋，涂布至MRS固體培養基上，于37 ℃恒溫培養箱倒置培養48 h，選取菌落數30～300之間的平板進行計數。按照公式(1)計算存活率[16]:

(1)

式中：Nt,各時間段的活菌數，CFU/mL；N0,0 h的活菌數，CFU/mL。

1.2.3 膽鹽耐受性

將2株魏斯菌種子液按4%的接種量接入膽鹽濃度分別為0.3、1.5、3 g/L的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養，分別于0、1、2、3 h從中吸取菌懸液，進行梯度稀釋，涂布至MRS固體培養基上，于37 ℃恒溫培養箱倒置培養48 h，選取菌落數30～300之間的平板進行計數。按照1.2.2中的公式計算存活率。

1.2.4 腸液耐受性

1.2.4.1 人工腸液的制備

0.18 g膽鹽、0.1 g胰蛋白酶、溶于無菌溶劑(1.1 g NaHCO3、0.2 g NaCl及100 mL蒸餾水)，用0.5 mol/L的NaOH調整pH值到7.0[17]。溶液過0.22 μm微孔濾膜除菌。

1.2.4.2 腸液耐受性的測定

將2株魏斯菌種子液按4%的接種量接入人工腸液中，放37 ℃恒溫培養箱中，分別于0、1、2、3 h從中吸取菌懸液，進行梯度稀釋，涂布至MRS固體培養基上，于37 ℃恒溫培養箱倒置培養48 h，選取菌落數30～300之間的平板進行計數。按照1.2.2中的公式計算存活率。

1.2.5 抑菌特性

1.2.5.1 指示菌種子液的制備

將沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種于LB液體培養基中，置37 ℃，120 r/min的搖床振蕩培養12～16 h至對數生長期，備用。

1.2.5.2 樣品的制備

將2株魏斯菌的發酵液于8 000 r/min離心15 min，得到發酵上清液，按如下方式制備樣品：(a)用6 mol/L NaOH將發酵上清液調至pH值6.5；(b)發酵上清液；(c)空白培養基，用乳酸調至pH值與發酵上清液相同；(d)空白培養基。上述4種樣品均通過無菌過濾膜(0.22 μm)除菌，備用。

1.2.5.3 抑菌活性的測定

用LB半固體培養基將3種指示菌種子液稀釋至菌數為106～107CFU/mL，倒平板。待培養基凝固后，用無菌鑷子將滅菌的牛津杯置于瓊脂表面，在牛津杯中注入200 μL上述4種樣品，放于37 ℃的恒溫培養箱中，正置培養過夜后，取出觀察，用游標卡尺測量抑菌圈直徑的大小[16]。

1.2.6 菌株對膽固醇和甘油三酯的降解特性

1.2.6.1 對膽固醇的降解特性

將2株魏斯菌接種至膽固醇培養基，于37 ℃下靜置培養48 h，將發酵液于8 000 r/min離心15 min，取上清，分別測定0 h和48 h發酵上清中的膽固醇濃度，按公式(2)計算膽固醇降解率[18]。

(2)

式中：C0，0 h發酵上清中的膽固醇濃度，mmoL/L；C48，48 h發酵上清中的膽固醇濃度，mmoL/L。

1.2.6.2 對甘油三酯的降解特性

將2株魏斯菌接種至甘油三酯培養基，于37 ℃下靜置培養48 h，將發酵液于8 000 r/min離心15 min，取上清，分別測定0 h和48 h發酵上清中的甘油三酯濃度，按公式(3)計算甘油三酯的降解率[19]。

(3)

式中：A0，0 h發酵上清中的甘油三酯濃度，mmoL/L；A48，48 h發酵上清中的甘油三酯濃度，mmoL/L。

1.2.7 菌株表面特性

1.2.7.1 表面疏水性的測定

采用碳烴化合物法(MATH)[20]。分別取2株菌的菌懸液離心(8 000 r/min，10 min)，棄上清，用磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 7.0)洗滌菌體2次后使菌重懸，調整菌懸液的OD600為0.8。在試管內加入4 mL菌液、1 mL正己烷，對照組不加正己烷，封口，用旋渦振蕩儀劇烈振蕩60 s，靜置15 min分層。吸取下相水溶液3.0 mL，以Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液為空白對照，在600 nm波長下測定吸光度，細菌細胞表面疏水性(cell-surface hydrophobicity, CSH)按公式(3)計算:

(3)

式中：A0，對照組光密度值；AS，實驗組光密度值。

1.2.7.2 表面凝集性

取5 mL按1.2.7.1所述方法調整好菌濃的菌懸液，于37 ℃恒溫箱靜置培養2 h后，輕輕吸取200 μL上層懸浮液，不搖動，測定其在600 nm波長處的光密度值，菌體凝集性按公式(4)計算[21]：

(4)

式中：OD0，菌懸液初始光密度值；ODt，菌懸液靜置后光密度值。

1.3 統計分析

實驗數據為3次重復的平均值，以平均值±標準方差(x±s)表示，采用Spss 16.0進行統計分析，采用Duncan’s ANOVA進行多重比較，不同處理組之間P<0.05表示差異性顯著。

2 結果與討論

2.1 耐酸性能

測定酸性條件下對2株菌存活的影響，結果見圖1。

圖1 pH值對WS-419(A)和ZY-6(B)存活率的影響

Fig.1 Effect of pH value on survival rate of WS-419(A) and ZY-6(B)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

可以看出，當pH為2時，隨時間的延長，2株菌的存活率皆出現了一定程度的下降(P<0.05)，3 h后WS-419和ZY-6的存活率分別為24.65%和45.18%；當pH升高時，隨時間的延長，2株菌的存活率都出現了增大的情況(P<0.05)，當pH為3時，WS-419和ZY-6在3h后的存活率分別為115.73%和118.58%；pH為4時，3 h后的存活率分別123.31%和133.18%，這可能是由于菌株的耐受性較好，當pH值較低時，并不能抑制其生長，而是出現了在培養基中隨培養時間的延長，菌體生長的現象。劉秀俠等在研究枯草芽孢桿菌的益生特性時，也有類

似發現[22]。總體看來，2株菌對酸性條件皆有一定的耐性，ZY-6的耐酸性稍強于WS-419，體現在同一pH條件下，ZY-6的存活率都高于WS-419(P<0.05)。

2.2 膽鹽耐受性

膽鹽會對微生物的生長產生一定的抑制作用[23]。正常情況下小腸內膽鹽質量濃度在 0.3～3.0 g/L[24]，因此，選擇0.3、1.5和3.0 g/L 3個濃度來考察菌株的膽鹽耐受性，結果見圖2。從圖2可以看出，2株菌在低、中、高濃度的膽鹽中，隨時間的延長，存活率皆有所下降(P<0.05)，但呈現出了一定的耐膽鹽特性。當膽鹽質量濃度為0.3 g/L時，3 h后，2株菌的存活率皆保持在90%左右；隨膽鹽濃度的升高，存活率出現了下降的情況，但在高膽鹽質量濃度下，WS-419和ZY-6在3 h后的存活率也較高，分別為72.05%和75.89%。總體說來，ZY-6和WS-419的膽鹽耐受性無明顯差異(P>0.05)。

圖2 膽鹽濃度對WS-419(A)和ZY-6(B)存活率的影響

Fig.2 Effect of concentrations of bile salt on survival rate of WS-419 (A) and ZY-6 (B)

2.3 耐人工腸液性能

考察2株菌在人工腸液中的存活情況，結果見圖3。從圖3可以看出，隨時間的延長，2株菌在人工腸液中的存活率出現了下降(P<0.05)，WS-419在2 h之前的存活率都保持在90%以上，3 h后的存活率降為85.47%；ZY-6的存活率在1 h后降為86.72%，隨著時間的繼續延長，存活率變化不顯著(P>0.05)。因此，2株菌均表現出了對人工腸液的較好抗性。

圖3 人工腸液測定

Fig.3 Determination of tolerance to simulated intestinal fluid

2.4 抑菌特性

益生菌可以作為腸道的保護屏障，抑制腸道病原菌，保持腸道微生態平衡[25]。選取3種常見的腸道致病菌：沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，考察2株魏斯菌對3種致病菌在平板上生長的抑制作用，并測定其抑菌圈直徑大小，結果見圖4和圖5。

A、C、E分別為WS-419對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用；B、D、F分別為ZY-6對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用；a-調中性的發酵上清；b-發酵上清液；c-調酸的空白培養基；d-空白培養基

圖4 兩株菌對指示菌的抑制作用

Fig.4 Inhibitory activities of the two strains against various pathogens

圖5 WS-419 (A)和ZY-6 (B)對指示菌產生的抑菌圈直徑

Fig.5 Diameter of inhibition zone of WS-419 (A)and ZY-6 (B) against various pathogens

可以看出，2株菌的發酵上清液對3種指示菌的生長皆呈現出了較好的抑制作用，且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制作用表現出逐漸增強的趨勢。WS-419發酵上清液對3種指示菌的抑菌圈直徑分別為(22.59±1.49)、 (25.82±0.20)、(27.96±0.04)mm；ZY-6分別為(22.61±0.90)、(27.02±0.53)、(30.53±1.40)mm。ZY-6對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果好于WS-419(P<0.05)；對于每種指示菌而言，發酵上清液的抑菌效果好于調酸的空白培養基(P<0.05)，可見，發酵過程中，除了產生有機酸如乳酸等使發酵液呈現酸性，對菌的生長產生酸抑制外，也會產生一些抑菌活性物質如細菌素等，與酸共同作用，從而呈現出更強的抑菌作用；調成中性的發酵上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌呈現出了較弱的抑菌效果，而空白培養基對3種指示菌皆無抑菌作用，這進一步驗證了發酵上清中存在抑菌活性物質，但具有一定的菌種選擇性。

2.5 降解甘油三酯和膽固醇特性

血清中膽固醇、甘油三酯含量過高，會誘發冠心病、腦中風、高血壓等心腦血管疾病，嚴重影響健康。因此，菌株對膽固醇、甘油三酯的降解能力是衡量益生菌益生特性的指標之一。由圖6可以看出，在分別含膽固醇和甘油三酯的培養基中培養48 h后，WS-419和ZY-6對膽固醇的降解率相似(P>0.05)，分別為32.79%和32.13%；對甘油三酯的降解率分別為42.80%和26.70%，WS-419對甘油三酯的降解能力強于ZY-6(P<0.05)。

圖6 菌株對膽固醇和甘油三酯的降解作用

Fig.6 Degradation of cholesterol and triglyceride by strains

2.6 表面特性

菌株的表面特性決定了菌株能否較好地黏附并定殖于消化道，以發揮其益生功效。測定2株菌的表面疏水性和表面凝集性，結果見表1。WS-419和ZY-6的表面疏水性分別為60.24%和61.41%，表面凝集性分別為67.30%和68.65%，2株菌具有相似的較好的表面特性(P>0.05)，因此，都具備黏附在腸道上皮細胞和黏膜表面上，以發揮其益生功效的能力。

表1 菌株的表面疏水性和表面凝集性 單位：%

注：同列數據中的不同字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 結論

綠色魏斯菌ZY-6和希臘魏斯菌WS-419是分離自傳統發酵食品泡菜中的2株乳酸菌，本文對其益生特性進行了比較研究：耐酸性和抑菌特性方面，綠色魏斯菌ZY-6更優，其在pH為2時，3 h后的存活率為45.18%，高于WS-419的24.65%；pH為3和4時，存活率分別為118.58%和133.18%。對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為22.61、27.02、30.53 mm，好于WS-419的22.59、 25.82、27.96 mm，這種抑制作用除來源于酸外，可能還和抑菌活性物質的產生有關。在降解膽固醇時，WS-419體現出更好的降解特性，降解率為42.80%，高于ZY-6的26.70%。ZY-6和WS-419益生特性大多相似：都具備較好的膽鹽耐受性，在3 g/L的膽鹽濃度中存活率分別為75.89%和72.05%；對人工腸液具有一定的抗性，3 h后的存活率維持在80%左右；2種菌具備降解膽固醇能力，降解率分別為32.79%和32.13%；表面疏水性分別為61.41%、60.24%；表面凝集性分別為68.65%、67.30%，皆顯示出較好的表面特性。2株魏斯菌呈現出的良好的益生特性表明，它們能夠克服體內環境，發揮其正常的益生作用，具備進行功能性食品開發的潛力。

綠色魏斯菌ZY-6和希臘魏斯菌WS-419同屬于魏斯氏菌屬，在某些益生特性如耐膽鹽、耐人工腸液、降膽固醇、表面特性方面表現出一定的相似性，但在耐酸性、抑菌特性、降甘油三酯方面又呈現出一定的差異，這可能是由于其分屬不同的種所致，后續可以深入探討其機制，從而為益生菌益生特性的研究提供理論依據。