西藏青稞小曲中優良微生物的篩選與鑒定

耿曉杰，張玉紅，薛潔，孫紀錄，閆寅卓*

1(河北農業大學 食品科技學院，河北 保定，071001) 2(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015) 3(西藏自治區農牧科學院 農產品開發與食品科學研究所，西藏拉薩，850032) 4(酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京，100015)

傳統青稞酒是以西藏糧食作物青稞為原料，加入青稞小曲糖化發酵而成，是西藏酒文化的代表，具有口感適宜、酒精度低以及營養功效高等特點[1]。

青稞小曲是采用傳統自然接種方式制作的釀酒發酵劑，含有豐富的微生物及酶[2]，參與釀酒過程中的糖化、液化、酒精發酵和風味的形成[3-4]。所以，青稞小曲中的微生物很大程度上決定了青稞酒的品質和風味。目前，由于地理位置、釀造工藝、制曲原料和環境等因素的影響致使青稞小曲質量不穩定[5-6]。

傳統的微生物學方法，如微生物計數，使用不同的普通和選擇性培養基，可以提供可培養的不同微生物數量以及用于酒發酵的分離的純培養菌株[7]。本文收集了來自西藏5個地區的21個青稞小曲樣品，采用傳統培養法對微生物進行分離鑒定，并篩選淀粉酶活力和蛋白酶活力高的菌種，為豐富青稞小曲中微生物菌群的研究，以及生產適合西藏地區青稞酒釀造的小曲，穩定和提升青稞酒的品質的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

青稞小曲：21種，均由西藏自治區農牧科學院提供，樣品信息如表1所示。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、平板計數瓊脂(plate count agar，PCA)培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司。

產糖化酶菌株初篩培養基[8]、產蛋白酶菌株初篩培養基[9]、麩皮培養基[1]。

細菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化試劑公司；6× Loading Buffer(上樣緩沖液)、10× PCR Buffer、Tap酶、DL5 000 DNA Marker，寶日醫生物技術(北京)有限公司；Gold View(核酸染色劑)，北京博奧拓達科技有限公司；通用引物(27F和1492R、ITS-1和ITS-4)，由華大基因公司合成；西班牙瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司；乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 4.6)，可溶性淀粉溶液(20 g/L)、NaOH溶液(質量分數20%)、葡萄糖標準溶液(2.5 g/L)、費林溶液、酪氨酸，HCl、0.4 mol/L Na2CO3溶液、福林試劑、pH 7.5磷酸鹽緩沖液、pH 3.0乳酸緩沖液、脫脂奶粉、0.4 mol/L三氯乙酸溶液、碘液，試劑均為分析純，北京化工廠。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；

表1 青稞小曲樣品的信息

注：“-”表示只精確到地區具體位置信息未定。

BX51顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；LRH-250培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；BC-C57 PCR儀，北京天林恒泰科技有限公司；BG-sub MIDI多用途水平電泳儀、BG-Power600通用電泳儀電源，北京百晶生物技術有限公司；Tanon 1600凝膠成像系統，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品中微生物的分離與純化

準確稱取1 g粉碎的青稞小曲樣品，無菌操作下，加入99 mL無菌生理鹽水(0.9%)中，振蕩2 min，使微生物均勻分散于生理鹽水中，制成10-2稀釋度的菌懸液，混合均勻，吸取1 mL 10-2菌懸液于9 mL無菌生理鹽水中，制成10-3菌懸液，混合均勻，依次作10倍逐級稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7菌懸液[10]。取適宜的3個稀釋度的菌懸液100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、PCA培養基上用于細菌菌落的培養和計數；涂布于孟加拉紅培養基、PDA培養基上用于真菌菌落的培養和計數，每種培養基的每個稀釋度都進行平行試驗并做空白對照以確保準確性。對于細菌，37 ℃培養3 d，對于真菌，28 ℃培養3 d，計數菌落，結果表示為每克樣品的菌落形成單位(colony-forming units，CFU)的對數(lg CFU/g)。另外，選取形態不同的菌落，進行劃線分離純化，并保藏于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 菌落與菌體形態的觀察

對分離純化的菌落進行觀察和描述；挑取純化的菌落于載玻片上，在顯微鏡下觀察菌體形態[10]。

1.3.3 微生物的分子生物學鑒定

1.3.3.1 DNA的提取

分別用細菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒和植物基因組DNA提取試劑盒對分離純化的細菌、酵母菌和霉菌DNA進行提取，提取步驟按試劑盒說明書進行。

1.3.3.2 PCR擴增及測序

PCR反應體系(25 μL)：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.3 μL，(細菌：27F；真菌：ITS1)上游引物1 μL，(細菌：1492R；真菌：ITS4)下游引物 1 μL，用ddH2O 補至25 μL[11-12]；

細菌反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性 45 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s(35次循環)，最后72 ℃延伸5 min[13]。

真菌反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性45 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s(35次循環)，最后72 ℃延伸8 min[14]。

PCR擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V，20 min，恒壓對PCR產物進行電泳[15]，并在凝膠成像系統下觀察，照相分析。

將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化和測序。

1.3.3.3 序列分析

測序結果在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)nucleotide中進行Blast比對分析；另外，用ContigExpress軟件對序列進行拼接及人工校正，生成Fasta格式文件，利用Mega 7軟件按照Neighbor-Joining法聚類構建系統發育樹。

1.3.4 優良細菌、霉菌菌株的篩選

1.3.4.1 初篩

用無菌牙簽蘸取平板上的菌株點接于產糖化酶初篩培養基上，霉菌，28 ℃培養72 h；細菌，37 ℃培養48 h；測量菌落直徑D，向培養皿中加入4 mL稀碘液，5 min后，測量透明圈直徑d，選擇比值d/D較大的菌株點接于產蛋白酶初篩培養基上，測量細菌菌落直徑D和透明圈直徑d，選擇比值d/D較大的菌株進行復篩[16]。

1.3.4.2 復篩

(1)霉菌孢子懸浮液的制備：于活化的菌株斜面倒入10 mL的無菌生理鹽水，用接種針刮下斜面上孢子，將試管中的孢子打散混勻，用血球計數板計數，并稀釋孢子數至106個/mL左右[17]。

(2)細菌種子液的制備：挑取1環細菌接種于營養肉湯培養基中，37 ℃、180 r/min，培養12 h[18]。

(3)接種培養：種子液/懸浮液按10% 的接種量接入麩皮培養基，混勻，細菌，37 ℃培養3 d(每天搖瓶2次)；霉菌，28 ℃培養72 h，進行扣瓶，繼續培養至6 d。于鼓風干燥箱內，40 ℃烘干12 h，備用[19-20]。

(4)按照QB/T 4257—2011測定麩曲的糖化力、液化力，按照GB/T 23527—2009測定蛋白酶活力。

2 結果與分析

2.1 可培養微生物計數

將收集的西藏青稞小曲樣品通過稀釋涂布培養，選取菌落數在30～300 CFU的平板計數可培養微生物總數,結果如表2所示。

表2 青稞小曲中可培養微生物計數結果

由表2可知，除了QK2外，其他青稞小曲的可培養微生物數均在108CFU/g左右，而湖北、安徽和四川地區小曲以及貴州黃酒酒曲和麥曲中可培養微生物數為106～107CFU/g左右[21-22]，表明青稞小曲樣品中的可培養微生物數量較多。

2.2 微生物的分離純化結果

選取涂布培養的平板上不同形態的菌落，通過劃線分離得到單一菌落。菌落形態如圖1所示。

圖1分別為酵母菌(a)、霉菌(b)和細菌(c)分離純化后的形態，其中，酵母菌比細菌菌落形態大，圓形，菌落呈白色，濕潤，菌落質地均勻，易挑取，有酒香味；霉菌菌落形態大，呈絨毛狀，菌落為黑白相間，質地疏松，干燥，菌落正面與反面的顏色不一致；細菌菌落形態小，隆起圓，菌落呈白色，表面光滑黏稠，易挑取，有酸敗味。另外，經傳統的分離純化培養法自西藏青稞小曲21個樣品中共分離純化得到優勢微生物278株。

a-酵母菌;b-霉菌;c-細菌

圖1 部分微生物的菌落形態

Fig.1 Colony morphology of partial microorganisms

2.3 菌落分子生物學鑒定結果及系統發育分析

通過對純菌株的菌落和菌體形態的觀察，挑選出57個單菌落進行鑒定。使用相應的試劑盒提取純菌株的DNA，再進行PCR擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測后，將電泳條帶較清晰、符合真菌(500～750 bp)或細菌的條帶長度(1 500～2 000 bp)的菌株送檢測序，圖2為部分菌株瓊脂糖凝膠電泳圖；然后對測序序列進行拼接及人工校正，再利用Mega 7和鄰接法對測序菌株構建系統發育樹，見圖3。

M-DL5000 DNA marker；1，2，3，4，5和6分別代表霉菌M6和M12、酵母菌J1和J2以及細菌Q11和Q12

圖2 部分菌株的16S rRNA(細菌)和ITS基因(真菌)PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S rRNA (bacteria) and ITS gene (fungi) from partial strains

圖2顯示，所擴增的目的片段電泳條帶較清晰，真菌條帶大小約為600 bp，符合真菌的條帶長度，細菌條帶大小約為1 500 bp，符合細菌的條帶長度，送檢測序，并將結果通過NCBI nucleotide中進行Blast比對分析，鑒定結果如表3所示。

由表3可知，從青稞小曲中分離出的優勢細菌分別是蠟樣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和Kocuriamarina；真菌分別為扣囊復膜孢酵母、釀酒酵母、Saccharomycop-sismalanga、米根霉、Coriolopsistrogii、卷枝毛霉、總狀毛霉、白囊耙齒菌、傘狀毛霉菌、米曲霉、黃曲霉、黑曲霉和毛栓菌。研究結果表明，西藏青稞小曲中真菌多樣性高于細菌，芽孢桿菌屬、復膜孢酵母屬和根霉屬是青稞小曲中的主要菌群。另外，湖北、安徽和四川地區小曲中均含有芽孢桿菌[21]，其也是低溫大曲和高溫大曲中的優勢菌[23-24]。說明芽孢桿菌對于酒曲的穩定和酒風味物質的產生具有很大的作用。CAI等研究結果表明根霉菌是中國甜米酒發酵劑中的優勢菌，并對釀造過程中的淀粉水解具有重要作用[25]；CHI等發現扣囊復膜酵母能夠分泌大量的淀粉酶、酸性蛋白酶和β -葡萄糖苷酶，在發酵行業具有很高的潛在利用價值[26]。因此，青稞小曲中篩選的優勢菌屬為優化制曲工藝提供了研究基礎。

表3 青稞小曲中微生物鑒定結果

由圖3可知，菌株M16和M23、X1和X2、J5和J8、M3和M9、QJ2和QJ3遺傳距離較近，表明親緣關系較近，而其他菌株的遺傳距離較遠，則菌屬差異較大，另外，系統發育樹結果表明了青稞小曲中微生物的多樣性。

圖3 西藏青稞小曲中微生物的系統發育樹

Fig.3 Phylogenetic tree for microbials in highland barley Xiaoqu

2.4 優良微生物的篩選

2.4.1 優良霉菌菌株的初篩

2.4.1.1 產糖化酶霉菌菌株的初篩

小曲中的霉菌主要起糖化作用，將原料中的淀粉轉化成還原糖用于其他微生物生長利用，本研究通過在含有可溶性淀粉的篩選培養基中培養分解淀粉的霉菌菌株，利用淀粉遇碘變藍的原理[27]，快速初篩得到糖化力較強的霉菌菌株，糖化透明圈如圖4所示，產糖化酶菌株初篩結果如表4所示。

表4 霉菌產糖化酶菌株初篩結果

注：“-”表示未有透明菌產生。下同。

糖化酶初篩培養基中以可溶性淀粉為唯一碳源，以碘作為顯色劑，平板中透明圈越大說明淀粉被糖化酶分解的越多，糖化酶活力越高，反之，越低。從表4中可以看出，霉菌菌株M1、M2、M4、M9、M14和M20未出現糖化透明圈，菌株M18、M21、M22和M23的d/D比值較小，而M3、M5、M6、M7、M8、M10、M12、M13、M15、M16和M19是相對糖化透明圈較大的11株霉菌菌株，表明這些菌株的糖化酶活力較高，所以，選取這11株菌進行產蛋白酶菌株初篩。

2.4.1.2 產蛋白酶霉菌菌株的初篩

研究表明，酒中的高級醇，主要來源于蛋白酶分解蛋白質所生成的氨基酸，另外，酒中的高級醇及其派生出來的酸、醛、酮和酯等，都是酒香氣的重要組分[9]。

所以，本研究通過在含有脫脂奶粉的篩選培養基中培養分解蛋白質的霉菌菌株，初篩得到糖化力較強且蛋白酶活力較強的霉菌菌株，產蛋白酶透明圈如圖4所示，產蛋白酶菌株初篩結果如表5所示。

蛋白酶初篩培養基中以脫脂奶粉為氮源，平板中透明圈越大說明脫脂奶粉被蛋白酶酶分解的越多，蛋白酶活力越高，反之，越低。由表5可得，除了霉菌菌株M5和M10無透明圈產生，其他菌株均有產蛋白酶的透明圈，本實驗擬篩選發酵性能優良的菌株。因此，選取糖化酶活力和蛋白酶活力都較高的菌株M3、M6、M7、M8、M12、M13、M15、M16和M19進行優良霉菌菌株復篩。

表5 霉菌產蛋白酶菌株初篩結果

a-霉菌糖化透明圈;b-細菌糖化透明圈;c-霉菌產蛋白酶透明圈;d-細菌產蛋白酶透明圈

圖4 部分微生物糖化和產蛋白酶透明圈

Fig.4 Transparent circles of saccharification and protease-producing of partial microorganisms

2.4.2 優良霉菌菌株的復篩

將初篩得到的9株霉菌菌株分別制成麩曲，測定霉菌麩曲具體的糖化力、液化力和蛋白酶活力值。

2.4.2.1 糖化力的測定

糖化酶可從淀粉的非還原性末端開始依次水解α - 1,4 -葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，常應用于微生物發酵中。在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g曲1 h轉化可溶性淀粉生成葡萄糖的質量，用費林試劑測定所生成的葡萄糖量，即為糖化力。結果如圖5所示。

圖5 9株霉菌糖化力測定結果

Fig.5 Determination results of saccharifying power of 9 molds

青稞小曲作為發酵青稞酒的糖化、發酵和生香劑，對酒體品質影響極大。糖化力是評價酒曲質量的重要指標之一，糖化力較高有利于對原料的充分利用且有利于提高出酒率。從圖5中可以看出，菌株M12、M7、M8和M19糖化力較高，糖化力分別為(1 382±77.38)、(1 294±91.85)、(1 288±89.8)、(1 055 ±48.88)mg/(g·h)，其他5株霉菌糖化力均低于1 000 mg/(g·h)，其中M3最低，糖化力為124±54.11 mg/(g·h)。

2.4.2.2 液化力的測定

液化酶能使淀粉由高分子狀態(淀粉顆粒)轉變為較低分子狀態(糊精)，在酒發酵過程中尤為重要。而在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g曲酶解1 h至試液對碘的藍紫色特征反應消失，根據所需時間可以計算液化的淀粉質量，即為液化力。結果如圖6所示。

圖6 9株霉菌液化力測定結果

Fig.6 Determination results of liquefying power of 9 molds

從圖6中可以看出，M16液化力最高，達到(4.65±0.25)g/(g·h)，其次為M15、M19、M7、M12，液化力分別為(1.85±0.07)、(1.78±0.01)、(1.6±0.05)、(1.39±0.05)g/(g·h)，其他菌株的液化力均小于1 g/(g·h)，液化力較高的青稞小曲可以促進對釀酒原料的利用率。

2.4.2.3 蛋白酶活力的測定

蛋白酶能夠水解原料中的蛋白質，增加碳源和氨基酸，加速其他微生物生長和風味氨基酸的產生[28]，由于釀酒過程中，pH值處于中性或者酸性環境中，所以，利用L-酪氨酸制作標準曲線，采用Folin-酚法[29]測定霉菌麩曲的中性和酸性蛋白酶活力。結果如圖7、圖8所示。

圖7 9株霉菌中性蛋白酶活力測定結果

Fig.7 Determination results of neutral protease activity of 9 molds

蛋白酶活力主要的作用是降解原料中的蛋白質，從而分解為風味氨基酸等，促成青稞酒終產品的風味。從圖7中可以看出，除了菌株M8、M16、M15和M13中性蛋白酶活力較低外，其他菌株中性蛋白酶活力都比較高，其中，菌株M19、M6、M12、M3均高于800 μg/(g·min)，中性蛋白酶活力分別為(944.51±13.49)、(881.82±6.36)、(869.87±56.75)、(826.88±213.9)μg/(g·min)。

圖8 9株霉菌酸性蛋白酶活力測定結果

Fig.8 Determination results of acid protease activity of 9 molds

由圖8可知，M13、M6、M3、M19、M12的酸性蛋白酶活力較高，分別為(531.85±3.09)、(285.33±5.38)、(174.19±49.41)、(158.31±57.51)、(81.02±20.68)μg/(g·min)，其他菌株均低于50 μg/(g·min)。結合糖化力、液化力和蛋白酶活力的測定結果，再加上霉菌在發酵過程中主要起糖化作用，M12糖化酶活力最高，為(1 382±77.38)mg/(g·h)，其他酶活力較強，所以，發酵性能優良且適用于發酵的菌株是M12。

2.4.3 優良細菌菌株初篩

2.4.3.1 產糖化酶細菌菌株的初篩

研究表明，酒在糖化過程中的優勢細菌通過環境誘導可產生耐高溫淀粉酶菌，有利于青稞酒的釀造生產[30]，所以，本研究通過糖化透明圈對細菌中產糖化酶菌株進行了初篩，細菌糖化透明圈如圖4所示，結果如表6所示。由表6可知，細菌菌株X1、X2、Q3、Q5和Q8無糖化透明圈產生，選擇產生透明圈的菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10、Q11、Q12和X4進行產蛋白酶菌株初篩，而且由表4和表6可得，可能是由于霉菌菌絲較發達，所以，細菌相對透明圈高于霉菌。

表6 細菌產糖化酶菌株初篩結果

2.4.3.2 產蛋白酶細菌菌株的初篩

通過產蛋白酶透明圈試驗，初篩得到糖化力較強且蛋白酶活力較強的細菌菌株，細菌產蛋白酶透明圈如圖4所示，產蛋白酶菌株初篩結果如表7所示。

表7 細菌產蛋白酶菌株初篩結果

由表7可知，產生糖化透明圈的細菌菌株中，只有X4和Q4產生蛋白酶篩選透明圈，說明沒有蛋白酶活力，或蛋白酶活力較低，所以選擇X4和Q4進行優良細菌菌株復篩。

2.4.4 優良細菌菌株復篩

由于細菌在青稞酒發酵過程中主要是產香類物質的作用，所以本研究將初篩得到的2株細菌菌株分別制成麩曲，只測定了細菌麩曲的蛋白酶活力，結果如表8所示。細菌菌株X4和Q4中性蛋白酶活力都較高，但是，菌株Q4略高于X4，且菌株Q4具有酸性蛋白酶活力，所以，發酵性能優良的細菌菌株是Q4。

表8 2株細菌酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力測定結果

3 結論

本文通過傳統培養法計數了西藏青稞小曲中可培養微生物，分離得到278株菌，其中細菌56株，真菌222株，通過形態學觀察和分子生物學鑒定，將篩選出的57株菌鑒定為蠟樣芽孢桿菌3株，沙福芽孢桿菌6株，短小芽孢桿菌2株，蘇云金芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌和Kocuriamarina各1株；真菌分別為扣囊復膜孢酵母13株，釀酒酵母2株，S.malanga七株，米根霉11株，C.trogii兩株，卷枝毛霉、總狀毛霉、白囊耙齒菌、傘狀毛霉菌、米曲霉、黃曲霉菌、黑曲霉和毛栓菌各1株。研究結果表明，西藏青稞小曲中真菌多樣性高于細菌，其優勢菌屬為芽孢桿菌屬、復膜孢酵母屬和根霉屬。通過透明圈法初篩和制曲復篩，得到中性蛋白酶活力最高為(1 035.56±40.09)μg/(g·min)，具有酸性蛋白酶活力的解淀粉芽孢桿菌1株以及糖化酶活力最高為(1 382±77.38)mg/(g·h)，液化力、蛋白酶活力都較高的米根霉1株。