甘南傳統牦牛酸奶來源抗氧化性乳酸發酵菌株的篩選

張俊，王炳文，趙保堂，何興芬，王嬌，楊富民*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅農業職業技術學院，甘肅 蘭州,730020)

乳酸菌是影響宿主健康的主要益生菌之一，有利于調節胃腸道平衡，具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用[1]。高發酵及抗氧化能力的乳酸菌不僅能提升酸奶制作效率,還有助于提升酸奶的抗氧化能力,在食品工業方面可以改善食品品質、延長保質期、增加功能特性[2-3]。依據哈曼的衰老自由基理論(free radical theory of aging, FRTA),機體氧化應激和老化密切相關,通過減少氧化損傷可延長壽命[4-5],合成抗氧化劑已被廣泛用于延緩食品脂質氧化,但由于對人體肝損傷和致癌等有副作用,使其安全性受到質疑[6]。尋找天然與高性價比的食品抗氧化劑以保護細胞免受ROS的影響顯得極其重要[7]。發酵乳品是我國農牧區的傳統食物，從傳統發酵食品中分離高發酵及高抗氧化能力的乳酸菌株在國內外已有較多的研究。DING等[8]從西藏牦牛酸奶中篩選出的德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)F17，具有較強的抗氧化能力與耐膽鹽能力，整體可提高食品的抗氧化能力。SHAKIBAIE等[9]從伊朗傳統乳制品中分離的短乳桿菌Lse，具有良好的益生和抗氧化能力。乳酸菌不僅具有降解亞硝酸以保護食品的作用[10]，而且產生的胞外多糖具有優良的抗氧化性能[11]。

有研究將乳酸菌的抗氧化性能歸因于傳統食物的發酵過程[12]，而從自然發酵牦牛乳中分離到的乳酸菌株的抗氧化特性尚未得到重視。在強烈紫外線輻射的條件下，菌株具備承受氧化應激的能力[8]。因此，從高原牦牛酸奶中篩選出高發酵及抗氧化活性的乳酸菌菌株有十分重要的意義。

本研究通過對甘南地區傳統發酵牦牛酸奶中高發酵及抗氧化能力的乳酸菌株的篩選，得到了1株發酵能力強、菌體抗氧化活性高的副干酪乳桿菌M5，這對開發我國西部傳統牦牛牧區的天然乳酸菌種資源、生產功能性乳制品和提高乳品附加值，具有一定的實用和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

在甘南州合作市佐蓋曼瑪鄉不同區域，采集4份傳統發酵牦牛酸奶。采用無菌注射器吸取樣品，并放進滅菌后的玻璃瓶內，密封存放于低溫采樣箱中，24 h之內運送回實驗室。

1.1.2 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),Solarbio；鄰菲啰啉、鄰苯二酚紫、鄰苯三酚,天津市光復精細化工研究所；MRS、BCP、YPD和MEA培養基采用的各種原料均符合國標。

1.2 儀器與設備

LX-B35 高壓滅菌鍋,深圳市佳博特試驗設備有限公司；JJ-CJ-2FD超凈工作臺,吳江市凈化設備總廠；TGL-20 高速臺式冷凍離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司；JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技服務有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

參照劉慧[13]方法，在無菌條件下，取25 mL樣品，加入到含有225 mL無菌水的三角瓶中(含玻璃珠)，振蕩搖勻后進行10倍梯度稀釋，涂布于MRS(含有質量分數為0.5%CaCO3)固體培養基中，于37 ℃下培養24 h。挑選出不同形狀并具有溶鈣圈的菌落接種于BCP培養基中，挑選能使BCP培養基由紫變黃的菌落，于MRS培養基上反復劃線分離純化為單菌落。

1.3.2 乳酸菌革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗和產乳酸定性試驗[14]

將純化后的菌株進行革蘭氏染色和H2O2(3%)觸酶試驗，選擇革蘭氏陽性、H2O2酶陰性試驗的菌株接種于MRS液體培養基中，于37 ℃培養24 h，菌懸液經4 000 r/min離心取上清液，采用紙層析法進行產乳酸的定性試驗。

1.3.3 篩選具有高過氧化氫耐受能力乳酸菌

參照王楨等[15]方法，將產乳酸的菌株，以3%的量(體積分數)接種于MRS液體培養基中。試驗組中H2O2濃度為1 mmol/L，對照組不進行任何處理。置于37 ℃恒溫振蕩搖床中培養24 h后，測量菌液在600 nm下的OD值。以耐受率高于60%為依據，篩選出具有高H202耐受性的菌株。

1.3.4 篩選具有優良益生性能與凝乳性能的乳酸菌

1.3.4.1 耐酸耐膽鹽能力測定

參照周晏陽等[16]方法，菌液以2%(體積分數)接種于MRS液體培養基，培養基的pH值調整為2.0與3.0，另一部分培養基中牛膽鹽的終質量分數為0.3%，將未經任何處理的培養基作為對照，于37 ℃下恒溫培養3 h，采用稀釋涂布平板法分別計算活菌數，并按公式(1)計算細菌的存活率，即菌株對酸與膽鹽的耐受能力。公式(1)如下所示。

(1)

1.3.4.2 凝乳性能測定

參考羅璠等[17]的方法，取新鮮牛奶4 000 r/min脫脂，95 ℃下滅菌5 min后，放置于42 ℃水浴鍋中。按照3%的接種量(體積分數)分別接入脫脂牛奶后，放入42 ℃恒溫培養箱中培養，計算各菌種的發酵凝乳時間。凝乳后放置于4 ℃冰箱中，發酵24 h后進行形態基本觀察。

1.3.5 乳酸菌不同組分制備

乳酸菌接種于MRS液體培養基，37 ℃培養24 h后，菌培液經6 000 r/min離心10 min后，分別收集上清液和菌體。上清液經過10 000 r/min離心5 min后，再用0.22 μm微孔膜過濾器過濾，即得無細胞的發酵上清液(cell-free supernatants，CFS)；菌體用無菌水洗滌2～3次，調整細胞密度OD600=1.0(約為1×109CFU/mL)，將所得菌懸液分為2組，1組作為完整細胞組(intact cells，IC)，另1組在冰浴條件下進行超聲破碎(300 W，25 min，處理5 s，間隔5 s)，經鏡檢沒有完整細胞后，進行8 000 r/min離心5 min處理，收集上清液，即可得無細胞提取物(cell free extracts，CFE)。

1.3.6 抗氧化活性的測定

1.3.6.1 DPPH清除率的測定

參考ZHANG[18]與LI等[19]的方法。取樣品1 mL，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2 mL，混勻后避光反應30 min后，在517 nm下測定吸光度，用1 mL蒸餾水和2 mL無水乙醇進行空白調零。計算見公式(2)。

(2)

式中：Ai，樣品組吸光度；Aj，對照組(乙醇+被測量物質)吸光度；A0，對照組(水+DPPH)吸光度。

1.3.6.2 ·OH清除率的測定

參考DING等[8]的方法。將1%(質量分數)的鄰菲啰啉1 mL加入到離心管中，依次加入2 mL的PBS(0.02 mol/L，pH 7.4)，1 mL蒸餾水，1 mL 2.5 mmol/L FeSO4，1 mL 20 mmol/L H2O2，于37 ℃恒溫水浴1.5 h。計算見公式(3)。

(3)

式中：Ap，在536 nm下測吸光度；As,1 mL樣品代替1 mL蒸餾水的吸光度；Ab,1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2吸光度。

參考陳明等[20]的方法，取2.8 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.2)溶液，加入0.1 mL鄰苯三酚(0.05 mol/L)和0.1 mL樣品。將反應液混勻，于25 ℃避光反應4 min后。迅速添加1 mL 8 mol/L HCl終止反應，在320 nm下測吸光度。按公式(4)計算。

(4)

式中：A0，沒有添加樣品的空白對照；Ai，添加樣品的吸光度。

1.3.7 酵母存活細胞模型測定

參考林祥娜[21]的方法并做修改，將意大利Enartis公司的紅佳釀酵母接種于YPD液體培養基中，28 ℃搖床培養12 h。將制備好的無細胞上清液、完整細胞組和破壁細胞在沸水中滅菌20 min。吸取0.1 mL酵母菌于5 mL的滅菌樣品中，于28 ℃搖床培養1 h后，加入終濃度為30 mmol/L的H2O2。繼續培養1 h后，吸取0.1 mL的菌懸液進行梯度稀釋，并涂布于MEA培養基上計數，如公式(5)。

(5)

式中：處理組，采用CFS、IC、CFE分別和H2O2處理；對照組，只用H2O2進行處理。

1.3.8 益生性與抗氧化菌株的鑒定

1.3.8.1 菌株生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》[22]對菌株進行初步鑒定。

1.3.8.2 16S rDNA鑒定以及系統發育樹的構建

將對數期的菌株用甘油保存好，送樣于青島派森諾基因生物科技有限公司進行菌種測序鑒定，包括細菌基因組DNA的提取、PCR的擴增、PCR產物的回收、序列的測定與回收。得到序列結果后在NCBI數據庫中進行比對，并用MEGA5軟件構建系統發育樹。

1.4 數據分析

采用Excel 2010分析處理數據，所有數據均重復3次試驗所得，并計算平均值和標準誤差，繪制圖表；采用SPSS 18.0軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化與初篩

從甘南傳統牦牛酸奶中初篩得到了18菌株，都具有較大溶鈣圈并使BCP培養基由紫變黃的能力；經過試驗發現有13株菌呈現出革蘭氏陽性；H2O2觸酶陰性；菌株發酵液的Rf值為0.7～0.8。進一步篩選發現，9株在1 mmol/L H2O2中的耐受率高于60%，結果見表1。

表1不同菌株初篩結果

注：“+”代表陽性;“-”代表陰性;Rf為樣品與2 %乳酸移動路徑的比值。

2.2 耐酸、耐膽鹽及凝乳性試驗

不同的菌株在pH 2.0與pH 3.0的生長環境下表現出不同的耐受性，存活率整體隨pH值升高呈現上升趨勢。在pH值為2.0的存活率為8.5%～25.5%。pH值為3.0的存活率為14.2%～70.2%，其中菌株M8在pH=3條件下存活率高達70%。大部分菌株耐膽鹽效果較好，存活率在高達30%以上。其中6株菌株的凝乳時間較短，凝乳時間為5～9 h，菌株M5的凝乳時間為6.2 h，表現出較好的凝乳發酵性能(表2)。

表2 不同菌株耐酸耐膽鹽與凝乳性能

注：同一處理的不同小寫字母表示處理內的差異顯著(P<0.05)。

2.3 抗氧化比較

2.3.1 DPPH自由基清除率

如圖1所示，6株乳酸菌的CFS、IC和CFE處理組均表現出了DPPH自由基清除能力，但不同菌株對DPPH自由基清除能力表現不同。CFS和CFE組中較強清除能力的為M5，IC組中清除能力較強的為T4和M11。總體來看，菌株M5的DPPH自由基清除能力最強，其中CFS處理組中清除率高達47.8%，顯著高于其他菌株的CFS處理組，其IC組合CFE組的清除率分別為42.7%和48.4%。

圖1 各菌株對DPPH自由基的清除效果

Fig.1 DPPH radical-scavenging ability of 6 screened strains

注：同一處理的不同小寫字母表示處理內的差異顯著(P<0.05)。(以下各圖與此相同)。

2.3.2 ·OH自由基清除率

由圖2可知，M5的CFS組對·OH的清除率為54.4%顯著高于其他組；CFE組中M8的清除能力較高為29.3%；IC組中M5、M8和Mx表現出較高的清除能力，分別為36.9%、34.4%和33.5%。相同菌株的·OH自由基清除能力中，CFS處理組高于IC和CFE處理組，乳酸菌清除羥自由基的活性物質主要存在菌體表面以及代謝產物中而非胞內。

圖2 各菌株對·OH自由基清除結果

Fig.2 Hydroxyl radical-scavenging ability of 6 screened strains

圖3 各菌株對的清除效果

以菌株的抗氧化能力為主，結合菌株的耐酸性以及高耐膽鹽和凝乳發酵性能，綜合選擇M5菌株進行后續試驗。

2.4 酵母存活細胞模型

酵母細胞的衰老代謝機制與人體細胞衰老機制相似[23]。在研究氧化應激損傷中，釀酒酵母是理想的生物模型，具有簡單而獨特的生長代謝規律[24]。由圖4可知，在加入乳酸菌的發酵上清液、完整細胞組和無細胞提取物后，經H2O2處理的酵母細胞的增長率都有所提高。增長率分別為130%、29%和95%，其中菌株M5的發酵上清液的氧化應激保護作用更加明顯，其增長率高達130%。

圖4 菌株M5對酵母細胞的保護

Fig.4 Protective effect of strains on S. cerevisiae

2.5 菌株形態生理生化鑒定

在MRS培養基上，菌株M5呈現乳白色圓形菌落；長度為1～2 μm，表面光滑濕潤凸起，邊緣整齊；為革蘭氏陽性、無芽孢、細長有彎曲的桿菌。通過該菌株的兼性厭氧觸媒試驗陰性、兼性異型發酵乳糖、不液化明膠的結果。根據《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》和《常見細菌系統鑒定手冊》初步將M5菌株鑒定為乳桿菌屬(表3)。

表3 菌株M5生理生化鑒定結果

注：“+”表示90%以上菌株為陽性；“-”表示90%以上出來為陰性；“d”表示 11%～89%菌株為陽性。

2.6 分子生物學鑒定

由于干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌等其他亞種親緣關系接近，很難利用傳統的發酵特性再進一步的區分，因此需要將表型特征和分子生物學技術結合起來對其進行鑒定[25]。目前在菌種鑒定中應用最廣泛的分子生物學技術是16S r DNA序列同源分析。將測序得到的序列在NCBI中進行同源性比對，并用MEGA5.0構建系統發育樹，結果見下圖5。由系統發育樹可知，M5菌株與副干酪乳桿菌JCM1171處于同一小分支，親緣關系最近，這跟形態及生理生化鑒定結果一致(圖6)。因此可以進一步將M5菌株確定是副干酪乳桿菌。

圖5 菌株M5的系統發育樹

Fig.5 Phylogenetic tree of strain M5

圖6 菌株M8、T4和M5的16S rRNA基因PCR擴增效果

Fig.6 Amplification of 16S rRNA gene of strains M8，T4 and M5 by PCR

3 討論

菌種的發酵性能直接關系到酸奶質量的好壞[26]，不僅影響酸奶的生產效率，而且影響酸奶的風味物質形成。發酵性能強的菌株，使牛奶中酸度下降過快，不利于凝乳質地的構建與后發酵中風味物質的形成，發酵時間過長則直接影響生產效率。凝乳時間是酸奶生產中非常重要的指標之一，對于工業化生產而言，一般要求發酵乳凝乳時間在5 h左右[27]。試驗篩選的菌株凝乳時間為6.2 h，低于市場上的商業菌株。菌株的凝乳狀態光滑細膩，可以通過后期的馴化和制備直投式發酵劑以增加菌株的發酵性能，用于工業化生產。

4 結論