鼠尾草提取物對鰱魚肌原纖維蛋白結構及功能特性的影響

魯小川，竇川林，尚永彪,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400716) 2(農業部農產品貯藏保鮮質量安全評估實驗室(重慶)，重慶，400716) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400716)

鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)又稱白鰱，四大家魚之一，肉質鮮嫩、味道鮮美、膠質蛋白含量豐富，并含多種人體所需的營養物質，具有潤肌膚、和氣血、補氣和烏發的功效[1]。目前，我國鰱魚市場以鮮活供應為主，供應半徑短，無法滿足產業化發展的需求，而鰱魚的工廠化屠宰加工是未來發展的必然趨勢。鰱魚在貯藏期間易發生微生物腐敗、脂肪和蛋白質的氧化，食用和加工品質下降，鰱魚的貯藏保鮮是困擾和限制著產業發展的一個難題。國內外對鰱魚的研究主要集中在養殖、病害防治等方面，保鮮方面的研究起步較晚。張進杰等[2]研究表明質量濃度為10 g/L的殼聚糖涂膜能有效改善鰱魚塊的感官品質且能延長3 d貨架期。楊華等[3]研究表明，在冰溫(-1.5±0.03)℃條件下，鯉魚魚糜制品貯藏期為3周。相關研究主要集中在貯藏過程中魚肉食用品質的變化，對貯藏過程中蛋白質氧化變化及其造成的加工特性變化等研究卻鮮有報道。

目前對于延緩蛋白質氧化的研究多通過添加抗氧化劑來實現，但化學抗氧化劑存在潛在的安全性問題。天然抗氧化劑多為植物提取物，其毒性遠遠低于化學抗氧化劑，應用前景廣闊。鼠尾草(SalviaOfficinalis)為唇形科一年生芳香性草本植物，主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區，共有900～1 100種，我國有84種[4]。鼠尾草的花、莖、葉均有較高的利用價值，且其資源豐富、成本低廉，故被廣泛用作醫藥、香料和食品行業的原料。鼠尾草中的一些成分能夠螯合金屬離子、清除自由基和單線態氧，具有較強的抗氧化能力[5-6]。章林等[7]的研究也證明了鼠尾草提取物具有良好的抗氧化能力。目前，已經有學者開展了鼠尾草提取物在動物性食品中的抗氧化效果的研究，如李玉邯等[8]研究發現添加10 g/L的鼠尾草提取物能明顯提高肉脯的抗氧化能力，并能保持肉脯良好的感官品質；MCCARTHY等[9]的研究顯示添加0.05%的鼠尾草到冷藏的生或熟豬肉餅中可有效地減少脂肪氧化并有一定的護色作用。但鼠尾草提取物在水產品中的抗氧化及防腐效果等相關研究還未見報道。

本文以新鮮鰱魚為原料，以人工合成抗氧化劑BHT和天然抗氧化劑TP為參照，從鰱魚肌原纖維蛋白質結構和功能特性2個方面入手，考察不同濃度的鼠尾草提取物的抗氧化效果，探討抗氧化機理，以期為鰱魚的貯藏保鮮提供理論基礎和應用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鰱魚(體態完好，體型均勻)，重慶市北碚區永輝超市；大豆油(食品級)，金龍魚集團股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UltraScan PRO色差儀，美國HunterLab公司；Avanti J-10高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；PHS-4C+酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；XHF-D內切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司； TA.XT2質構儀，英國stablemicrosystem公司； PowerPacBasic小型垂直電泳槽，美國Bio-Rad公司；G:BOX凝膠成像系統，美國基因公司；722-P可見分光光度計，上海現科儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器，上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 試樣處理

將鮮活白鰱宰殺，去頭、去鱗、去內臟，洗凈后切片，分別用蒸餾水(空白)、質量濃度10、20、30 g/L鼠尾草提取物、質量濃度0.1 g/L BHT、10 g/L TP溶液浸泡30 min，取出后瀝干，托盤包裝覆上保鮮膜，置于4 ℃下備用。

1.3.2 MP的提取及濃度的測定

參照ZHANG[10]和CHIN[11]的方法并做適當修改。以20 mmol/L，pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液為提取液，0.1 mol/L NaCl為漂洗液。MP的提取和貯藏均在4 ℃的條件下完成，3 d內完成相關指標的測定。MP濃度的測定采用雙縮脲法，牛血清蛋白為標準蛋白[12]。

1.3.3 MP結構指標的測定

1.3.3.1 羰基含量的測定

參照BAHAR[13]的方法并做適當改動，在10 mL離心管中加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(DNPH)，室溫下反應1 h后，加1 mL 20%三氯乙酸，振蕩后離心(12 000 r/min，3 min，4 ℃)，棄上清液，用1 mL乙酸乙酯和乙醇(1∶1，V/V)混合物清洗3次，收集沉淀，將沉淀溶于3 mL 6mol/L鹽酸胍溶液中，并于37 ℃恒溫水浴下保持15 min，離心(12 000 r/min，3 min，4℃)后取上清液于370 nm處測吸光值。用22 000 L/(mol·cm)的摩爾吸光系數計算羰基含量。

1.3.3.2 巰基含量的測定

調整待測MP的質量濃度為5 mg/mL，溶于9 mL 0.05 mol/L，pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中并加入1 mL樣液，充分混勻，取4 mL混合液，加0.4 mL 0.01 mol/L 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)和0.05 mol/L醋酸鈉溶液，振蕩搖勻后在40 ℃下保溫25 min。以不加DTNB樣品為對照，在412 nm下測定吸光值[12]。

1.3.3.3 SDS- PAGE凝膠電泳

參照LAEMMLI[14]的方法，將樣液(4% SDS，質量分數0.02%溴酚藍，質量分數20%甘油，質量分數10% β-巰基乙醇，0.125 mol/L，pH 6.8的Tris-HCl緩沖液)調節成蛋白質質量濃度為1.5 mg/mL，振蕩1 min，100 ℃水浴下保溫3 min，高速離心10 min后備用。電泳分離膠、濃縮膠濃度分別為10%和5%，上樣量為15 μL，標準蛋白上樣為5 μL。

1.3.4 MP功能特性指標的測定

1.3.4.1 溶解度的測定

參照AGYARE等[15]的方法。取一定量MP溶于4 ℃磷酸緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4，0.6 mol/L NaCl，pH 6.25)中，低速混合勻漿36 s，使蛋白質充分溶解，雙縮脲法測得的蛋白質溶液的濃度記作C1。冷藏(4 ℃)1 h，于5 500 r/min條件下冷凍離心15 min，用雙縮脲法測定的離心后的MP的濃度記作C2，空白用磷酸緩沖溶液替代。即MP溶解度按公式(1)計算。

(2)

1.3.4.2 乳化性的測定

采用濁度法測定MP的乳化性[16]。

1.3.4.3 表面疏水性的測定

參照CHIN[11]的方法，用0.02 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液調整蛋白質量濃度為5 mg/mL。向離心管中加入1 mL樣液和200 μL 1 mg/mL溴酚藍，在室溫下反應10 min，離心(3 000 r/min，10 min，20 ℃)后取上清液，上清液稀釋10倍后于595 nm處測定吸光值，空白以磷酸緩沖液代替樣液進行測定。

1.3.5 MP凝膠性質的測定

1.3.5.1 凝膠的制備

參照李艷青[17]的方法并做修改，將MP配成質量濃度160 mg/mL的溶液，裝入10 mL小燒杯中在80 ℃水浴加熱30 min，待凝膠形成后取出并冷卻至室溫，在4 ℃下貯藏備用。

1.3.5.2 凝膠質構(texture profile analysis, TPA)的測定

取出待測MP凝膠，在室溫下放置30 min后采取TPA模式進行質構測定。參數如下：探頭TA10；測前速度5 mm/s；測中速度1 mm/s；測后速度1 mm/s；壓縮比50%；觸發力5 g；觸發類型Auto。

1.3.5.3 凝膠保水性的測定

取出待測樣品放置30 min后，稱重記m1，離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)，去上清液，稱重記m2。每個樣品測定3次，取平均值，m0為離心管質量[18]。凝膠保水性按公式(2)計算。

(2)

1.3.5.4 凝膠白度的測定

取出待測樣品，室溫下平衡30 min后，用吸水紙吸去表面水分，切成1 cm厚圓柱體，用色差儀進行凝膠白度值分析，測定L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)[19]。凝膠白度值按公式(3)計算。

(3)

1.3.6 數據處理

每個試驗重復3次，每次3個平行樣品，結果取平均值。用Excel、Origin 8.5和SPSS Statistics 20.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP結構的影響

2.1.1 羰基含量的變化

圖1 冷藏條件下鰱魚MP羰基含量的變化

Fig.1 Changes of carbonyl content in MP of chub under cold storage

新鮮鰱魚的羰基含量為15.73 μmol/L，貯藏過程中對照組的羰基含量上升速率最快，高于其他試驗組，經過9 d的貯藏后，對照組羰基含量增加了88.05%，10 g/L SE組、20 g/L SE組、30 g/L SE組、BHT組和TP組分別增加了63.25%、56.96%、60.39%、61.16%和54.67%，處理組羰基含量增加值明顯小于對照組，表明SE和BHT、TP均可以不同程度地抑制MP的氧化，且20 g/L SE組和TP組對MP的抗氧化效果最好。丁景等[21]在研究5種抗氧化劑對微凍泥鰍MP的功能特性的影響時指出BHT可以有效抑制MP氧化，這與本試驗結果一致。

2.1.2 巰基含量的變化

巰基基團是MP中很活躍的功能基團，其含量變化影響MP空間結構的穩定性[22]。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP巰基含量的影響如圖2所示，從圖2中可看出，巰基含量隨著貯藏時間的延長而逐漸下降，這可能是因為在貯藏過程中暴露在蛋白質表面的巰基不斷被氧化形成二硫鍵，導致巰基含量不斷減少[17]。新鮮鰱魚MP的巰基含量為6.31 nmol/105g蛋白質，經過9 d貯藏后，對照組巰基含量下降了70.21%；10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組分別下降了67.83%、63.39%、64.66%、66.46%和67.67%。對比發現，對照組巰基含量下降最快，20 g/L SE處理組下降較為緩慢。這表明鼠尾草提取物、TP和BHT均可抑制鰱魚MP中的巰基的氧化，且20 g/L的鼠尾草提取物對MP的抗氧化效果最好，鼠尾草提取物的抗氧化機理可能與其自身含有的酚類物質有關。本試驗鰱魚肌原纖維蛋白在貯藏過程中的總體變化趨勢與榮建華等[23]研究的脆肉魷魚肉肌動球蛋白巰基含量在低溫貯藏中的變化趨勢相類似。

圖2 冷藏條件下鰱魚MP巰基含量的變化

Fig.2 Changes of sulfhydryl content in MP of chub under cold storage

2.1.3 SDS-PAGE分析

蛋白質的氧化主要是蛋白質通過轉氨基、脫羧基、脫氨基作用形成一系列小分子物質或者一些氧化產物發生聚集形成大分子物質。因氧化導致了分子量的變化，故SDS-PAGE凝膠電泳法通過對不同分子量的蛋白質分離能反映蛋白質分子的斷裂、交聯聚合程度[24]。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP SDS-PAGE的影響如圖3。從中可以看出，冷藏5 d時各試樣間肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的條帶無很明顯的差異，表明此時各試樣的肌原纖維蛋白雖然發生了一定程度的氧化，但還沒有產生嚴重的交聯聚合。冷藏9 d后各個試樣的肌球蛋白重鏈和肌動蛋白明顯減弱，但第4、5和6泳道的條帶相似且比第1、2和3泳道的條帶粗，說明30 g/L SE處理能更好地抑制因氧化導致的蛋白質的交聯和聚合且抑制效果與0.1 g/L BHT及1 g/L TP相當。

M-marker；1-6分別為對照、10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、0.1 g/L BHT和1 g/L TP

圖3 冷藏條件下鰱魚肌原纖維蛋白的SDS-PAGE電泳分析

Fig.3 SDS - PAGE electrophoresis analysis of silver carp myofibrillar protein under cold storage

2.2 鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP功能特性的影響

2.2.1 溶解度的變化

蛋白質的溶解性是其基本的物理性質，能直接反映蛋白質變性和聚集的變化程度[25]。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP溶解度的影響如圖4所示，從圖4中可以看出，MP的溶解度隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，溶解度降低可能是由于在貯藏過程中蛋白質變性和微環境的變化導致了不溶性大分子量蛋白質聚集體的形成，使蛋白質溶解性降低[26]。蛋白質結構發生變化會暴露其疏水基團，疏水相互作用會使蛋白質發生凝聚，從而導致其溶解度下降。新鮮鰱魚MP的溶解度為66.08%，經過9 d的貯藏，對照組鰱魚MP的溶解度下降為45.51%，而10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組溶解度依次為49.57%、50.77%、50.29%、49.29%和51.45%，下降幅度顯著低于對照組，這可能是由于鼠尾草提取物具有較強的抗氧化性，較好地抑制了蛋白質的氧化變性，延緩了蛋白質溶解度的下降速度。

圖4 冷藏條件下鰱魚MP溶解度的變化

Fig.4 Changes of MP solubility of chub under cold storage

2.2.2 乳化性的變化

蛋白質既有親水基團，又有疏水基團，故而具有一定的乳化性，其乳化能力用乳化活性指數(emulsifying activity index, EAI)和乳化穩定性指數(emulsifying stability index, ESI)衡量。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP乳化性的影響如圖5和圖6所示。

圖5 冷藏條件下鰱魚MP乳化活性的變化

Fig.5 Changes of MP emulsifying activity of chub under cold storage

圖6 冷藏條件下鰱魚MP乳化穩定性的變化

Fig.6 Changes of MP emulsifying stability of chub under cold storage

從中可以看出，鰱魚MP的EAI和ESI均隨著貯藏時間的延長呈持續下降趨勢，這可能是因為隨著貯藏時間延長MP發生了氧化變性，蛋白質原有空間結構被破壞，肌球蛋白交聯程度增加，其表面吸附脂肪顆粒的能力下降，從而降低了蛋白質的乳化活性[27]。李艷青[17]的研究也表明蛋白質氧化會導致其乳化性能降低。對照組、10 g/LSE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組鰱魚MP初始EAI分別為6.73、6.97、6.83、6.93、7.01和6.93 m2/g，貯藏9 d后，分別降低至0.89、1.25、1.46、1.52、1.49和1.35 m2/g；初始ESI分別為72.27%、73.01%、72.42%、74.42%、73.67%和72.87%，9 d后分別降至46.29%、49.60%、51.54%、52.37%、50.29和51.63%。統計分析表明，鼠尾草提取物濃度越大，EAI和ESI下降越慢。

2.2.3 表面疏水性的變化

蛋白質的表面疏水性是指蛋白質分子與水分子間相互排斥的物理性質，是常用的衡量蛋白質變性程度的指標。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP表面疏水性的影響如圖7所示。

圖7 冷藏條件下鰱魚MP表面疏水性的變化

Fig.7 Changes of MP surface hydrophobicity of chub under cold storage

從圖7中可以看出，鰱魚MP的表面疏水性隨著貯藏時間的延長呈現持續上升趨勢，這可能是因為在貯藏過程中鰱魚MP發生了變性，蛋白質的構象隨著變性程度的加深發生變化，其表面疏水性氨基酸基團逐步暴露，表面疏水性逐漸增大。對照組和10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組的溴酚藍初始結合量分別為20.44、19.35、19.12、18.87、19.17和20.19 μg，在貯藏過程中，0～3 d溴酚藍結合量上升緩慢，3～9 d溴酚藍結合量上升較快，MP與溴酚藍的結合量越大，說明其疏水性越強[15]。與對照組相比，其他處理組的溴酚藍結合量顯著低于對照組(P<0.05)，且鼠尾草提取物濃度越大，溴酚藍結合量越小。本結果與呂衛金等[28]的研究結果相一致。

2.3 鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP凝膠特性的影響

2.3.1 凝膠質構(TPA)的變化

凝膠具有連續網狀結構，凝膠固形物浸沒在液體介質中不具有穩定的流動性[29]。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP凝膠硬度的影響如圖8所示。

圖8 冷藏條件下鰱魚MP熱誘導凝膠硬度的變化

Fig.8 Changes of MP heat-induced gel hardness of chub under cold storage

從圖8可以看出，鰱魚MP的凝膠硬度隨著貯藏時間的延長均呈顯著下降的趨勢(P<0.05)；整個貯藏期間處理組的蛋白凝膠硬度均大于對照組(P<0.05)。初期對照組和10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組鰱魚MP凝膠硬度分別為80.00、79.33、82.33、81.33、80.00和80.00 g，9 d后，分別降低了32.09%、28.15%、28.34%、25.82%、27.50%和25.00%。這表明鼠尾草提取物、BHT和TP可以有效抑制貯藏過程中鰱魚MP凝膠硬度的降低，且30 g/L SE效果最佳。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP凝膠彈性的影響如圖9所示。

圖9 冷藏條件下鰱魚MP熱誘導凝膠彈性的變化

Fig.9 Changes of MP heat-induced gel springiness of chub under cold storage

從圖9中可看出，鰱魚MP的凝膠彈性隨著貯藏時間延長而顯著下降大于對照組(P<0.05)；整個貯藏期間處理組的蛋白凝膠彈性均(P<0.05)；初期對照組和10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組初始凝膠彈性分別為4.10、4.16、4.13、4.19、4.22和4.15，9 d后，分別降低了26.34%、23.56%、21.79%、21.00%、22.75%和21.93%。這表明SE和BHT、TP可以顯著抑制冷藏過程中鰱魚MP凝膠彈性的減弱(P<0.05)，且30 g/L SE的效果最好，但與20 g/L SE差異不顯著。鰱魚MP熱誘導凝膠硬度和彈性的持續下降可能是因為在貯藏過程中肌肉組織發生了不同程度的生化反應，其內部結構(分子間作用力、官能團等)和外部條件(pH、溫度等)發生了變化，蛋白質的高級結構發生改變，蛋白質間的交聯程度降低，無法形成穩定的三維網狀空間結構，從而蛋白質凝膠形成能力下降[30]。而處理組凝膠強度和彈性下降較緩是由于SE、BHT和TP抑制了蛋白質的氧化變性。這一結果與林靜[31]研究的茶多酚對微凍泥鰍MP及魚糜凝膠特性的影響結果一致。

2.3.2 凝膠保水性的變化

蛋白質的一些基團(主肽鏈基團、帶電基團、Gln的酰胺基等)可與水分子結合，而其熱誘導凝膠的保水性與氨基酸組成相關，水合能力與帶電氨基酸數呈正相關[32]。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP凝膠保水性的影響如圖10所示。

圖10 冷藏條件下鰱魚MP熱誘導凝膠保水性的變化

Fig.10 Changes of MP heat-induced gel water-holding of chub under cold storage

從圖10中可以看出，鰱魚MP熱誘導凝膠的保水性與貯藏時間和處理方式有關。各處理組鰱魚MP熱誘導凝膠的保水性隨著貯藏時間延長均呈現下降趨勢(P<0.05)。新鮮鰱魚MP熱誘導凝膠的保水性最好，為87.47%，貯藏9 d后，對照組和10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組的保水性分別下降了31.04%、23.84%、21.84%、21.81%、22.88%和23.28%。這可能是由于隨著蛋白質的不斷氧化，其空間效應和靜電效應發生改變，凝膠微觀結構被破壞，保水性降低[33]。于建行[34]研究表明，蛋白質隨著貯藏時間的延長逐漸變性，MP中的肌動蛋白和肌球蛋白轉化成肌動球蛋白，減弱了熱誘導凝膠的空間三維結構，從而使得保水性下降，XIONG等[35]的研究同樣表明蛋白質氧化是熱誘導凝膠保水性下降的重要原因，這與本研究結果一致。

2.3.3 凝膠白度值的變化

凝膠白度值對魚肉制品的感官評價至關重要，其變化情況與蛋白質變性程度有關[36]。鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP凝膠白度值的影響如圖11所示。

圖11 冷藏條件下鰱魚MP熱誘導凝膠白度值的變化

Fig.11 Changes of MP heat-induced gel whiteness of chub under cold storage

從圖11中可看出，鰱魚MP熱誘導凝膠白度值隨貯藏時間延長呈持續下降趨勢。新鮮鰱魚MP熱誘導凝膠白度值為77.46，貯藏9 d后，對照組和10 g/L SE、20 g/L SE、30 g/L SE、BHT、TP處理組鰱魚MP凝膠白度值分別下降了14.43%、12.96%、11.53%、11.52%、10.64%、12.02%。處理組的凝膠白度值下降幅度要顯著低于對照組，其中20 g/L SE、30 g/L SE、TP處理組凝膠白度值差異不顯著(P>0.05)，BHT處理組效果最佳，這可能是由于BHT能更加有效地抑制鰱魚MP的氧化變性。另一方面，羰基含量的增加會使其與蛋白質氨基發生美拉德反應，生成有色物質從而使凝膠白度值下降[30]。還有研究表明熱誘導凝膠白度值與脂肪氧化、保水性、還原酶的活性相關[37]。

3 結論

本研究通過對比發現鼠尾草提取物對冷藏鰱魚MP的氧化具有顯著的抑制作用。在整個貯藏過程中，試驗組MP的溶解度、巰基含量、乳化性質、凝膠硬度和彈性、凝膠保水性和凝膠白度值下降程度均顯著低于空白對照組，羰基含量和表面疏水性的上升程度顯著低于空白對照組，30 g/L的鼠尾草提取物對MP氧化的抑制效果與參照組相當。綜合分析表明，20 g/L的鼠尾草提取物的抗氧化效果最好，能很好地保持鰱魚的加工品質，延長其貨架期，這為鼠尾草提取物在水產品保鮮方面提供了理論支撐，同時鼠尾草作為一種安全的天然食材，來源豐富，成本低廉，其良好的抗氧化效果使得其具有較高的開發應用前景，可作為繼茶多酚之后的又一天然抗氧化劑被推廣。