米曲霉和魯氏酵母協同發酵優化合浦珠母貝肉酶解液風味

趙永強，王安鳳，陳勝軍*，楊賢慶，李來好，吳燕燕，楊少玲

1(中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發中心，廣東 廣州，510300) 2(江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港，222005) 3(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

合浦珠母貝(Pinctadafucata)是我國海水珍珠培育的主要品種，占海水珍珠培育總產量的90%以上[1]。作為采珠后副產物，每年有大量合浦珠母貝肉未得到充分利用。合浦珠母貝肉富含多種營養物質及活性成分，具有重要的食用和藥用價值，研究表明貝肉中糖胺聚糖具有免疫調節與抗腫瘤等多種功能活性[2-3]。以合浦珠母貝肉為原料，通過酶解制備貝肉水解液，水解液中含有豐富的游離氨基酸、多肽和礦物質等營養成分，但是存在腥味重，香氣不協調等缺點，需要進一步優化酶解液的風味[4]。

米曲霉具有較強的蛋白質分泌能力和食品安全性，其分泌的蛋白酶可將蛋白質水解，增強發酵液的風味，并可加快發酵進程[5]。何炘[6]和夏克勝[7]分別利用米曲霉發酵來改良貽貝蒸煮液和馬氏珠母貝肉呈味基料的風味。魯氏酵母是一種增香酵母，在發酵期間可產生醇、呋喃等多種風味物質[8-9]。近年來，利用微生物發酵來改良水產品風味的研究已多見報道[10-13]。相關研究表明，復合菌種發酵過程中產生的酶系更加復雜，可顯著改良水產品風味[14]。因此本文采用米曲霉和魯氏酵母菌協同發酵，以發酵液風味值和游離氨基態氮含量為考察指標，優化合浦珠母貝肉酶解液的發酵工藝，為發酵型海鮮調味料的生產提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

合浦珠母貝肉酶解液，由實驗室前期酶解試驗所得；大豆粉、大麥粉，購于當地超市；風味蛋白酶(≥120 U/mg)、復合蛋白酶(≥120 U/mg)，統一購于廣州市齊云生物技術有限公司；魯氏酵母菌、米曲霉(滬釀3.042孢子粉)，購于沂源康源生物科技有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、HCHO，購于廣州化學試劑廠，分析純。

1.2 儀器與設備

YXQ-SG46-280S型滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；Akku-drive型電位滴定儀，德國赫施曼公司；DHG-9240A型鼓風干燥箱，上海恒科儀器有限公司；Delta320型精密pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-8型數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；3K30型高速冷凍離心機，德國Sigma公司；SLI-700型恒溫培養，上海愛朗儀器有限公司；GB204型電子天平，瑞士METTLER公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

取適量合浦珠母貝肉酶解液，經高溫高壓滅菌后冷卻至室溫貯藏待用，菌種經活化與擴大培養后接種至酶解液中進行發酵，隨后取發酵液進行風味值和游離氨基態氮含量檢測。

1.3.2 菌種活化

將面粉和大豆粉按1∶3的質量比加適量清水混勻后，放高溫蒸汽滅菌鍋里，121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫后接入0.1%(以混合后物料總量計)的干菌種，在培養箱里培養一段時間，取樣、粉碎，測活菌落數，備用。

1.3.3 曲種中活菌數的測定

菌落總數的測定參考文獻[15]。

1.3.4 曲種的制備

將活化好的菌種添加到面粉與大豆粉混合制備的培養基里，進行擴大培養。通過稀釋平板計數法，使曲種的菌體濃度保持在(0～1)×108CFU/g，備用。

1.3.5 合浦珠母貝肉酶解液的發酵

將經水解后的合浦珠母貝肉酶解液調整pH至7.0，隨后添加適量NaCl及擴大培養的曲種，曲種菌體濃度為(1～5)×108CFU/g。采用兩段式發酵方式，先添加米曲霉進行有氧發酵，隨后添加魯氏酵母菌進行無氧發酵，2種菌發酵時間各占總發酵時間的1/2。

1.3.6 發酵液感官風味評定

由12名(6男，6女，20～35歲)具有感官評定經驗的人員組成評定小組，事先規定好評定標準，以對發酵后腥味、鮮香度、協調性、醇厚感等主要指標進行評定。然后參照GB/T14454.1—2008[16]、GB/T10220.1—2012[17]與GB/T10221.1—2012[18]進行感官評定。評定前將經冷藏過的貝肉發酵液加熱至室溫，并對其進行標號后讓評定員打分，評定員每評定1個樣品后需漱口，并休息1 min之后再評定下1個樣品，具體評定標準如表1。

表1 合浦珠母貝肉發酵液感官評分標準

1.3.7 發酵液中氨基態氮含量的測定

發酵液中游離氨基氮含量的測定采用甲醛點位滴定法[19]。

1.3.8 微生物發酵單因素影響試驗

(1)米曲霉和魯氏酵母菌的添加比例對貝肉發酵液風味值及游離氨基態氮的影響

總發酵時間為72 h，發酵溫度30 ℃，接種量5%，分別測定不同菌種比例(米曲霉∶魯氏酵母=3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對貝肉發酵液風味值及游離氨基氮含量的影響。

(2)菌種的接種量對貝肉發酵風味值及游離氨基態氮的影響

總發酵時間為72 h，發酵溫度30 ℃，菌種比例1∶1，分別測定不同菌種添加量2%、3%、4%、5%、6%對貝肉發酵液風味值及游離氨基氮含量的影響。

(3)發酵溫度對貝肉發酵風味值及游離氨基態氮的影響

總發酵時間為72 h，菌種比例1∶1，接種量5%，已知米曲霉最適生長溫度30～35 ℃[20]，魯氏酵母最適溫度為28～30 ℃[21]，因此分別測定2菌種混合發酵溫度28、29、30、32、34 ℃時對貝肉發酵液風味值及游離氨基氮含量的影響。

④發酵時間對貝肉發酵液風味值及游離氨基態氮的影響

菌種比例1∶1，發酵溫度30 ℃，接種量5%，分別測定不同菌種總發酵時間為56、64、72、80、88 h，對貝肉發酵液風味值及游離氨基氮含量的影響。

1.3.9 微生物發酵正交優化試驗

根據單因素試驗結果，研究進口溫度(A)、進料流量(B)、麥芽糊精添加量(C)3個因素對噴霧干燥產品的水分含量及感官評分的影響，選用正交表L9(34)進行三因素三水平的正交試驗，確定合浦珠母貝肉調味液噴霧干燥的最佳工藝，正交試驗因素與水平如表2所示。

表2 發酵工藝優化正交試驗因素與水平

注：A-米曲霉； B-魯氏酵母菌。

1.3.10 數據處理

數據分析采用Microsoft Excel 2016軟件進行分析，在檢驗水平為0.05的條件下進行顯著性差異分析，且所有實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 菌種添加比例

米曲霉和魯氏酵母菌的添加比例對貝肉發酵液風味值及游離氨基態氮含量的影響結果見圖1。由圖1可知，隨著魯氏酵母菌添加比例的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風味值和游離氨基態氮含量都呈現先增加后降低的趨勢。在米曲霉∶魯氏酵母=1∶2時，貝肉酶解液的風味值達到最高值(76.98±1.12)，但在增加或降低魯氏酵母菌的添加比例時，風味值都會降低，這可能是因為菌種比例的變化，導致微生物代謝產物中風味物質的變化進而影響發酵液的口感，風味值隨之降低[22]。在米曲霉∶魯氏酵母=1∶1時，貝肉酶解液的游離氨基態氮含量達到最高值(2.73±0.08) g/L，但在增加或降低魯氏酵母菌的添加比例時，游離氨基態氮含量都將會降低，這因為菌種的生長繁殖受多方面影響，接種量并不一定和氨基氮含量呈正相關[23]。綜合考慮風味值和游離氨基態氮在米曲霉∶魯氏酵母=1∶1和1∶2時2項指標的變化情況，選取最佳菌種添加比例為1∶2。

圖1 菌種比例對發酵液風味值及游離氨基態氮含量的影響

Fig.1 Effect of strain ratio on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

2.2 菌種接種量

菌種接種量對貝肉發酵風味值及游離氨基態氮含量的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著總接種量的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風味值和游離氨基態氮含量都呈現先增加后降低的趨勢。在接種量為5%時，貝肉酶解液的風味值達到最高值(76.67±0.33)，但在增加或降低菌種添加量時，風味值都會降低，這可能是因為接種量的變化，導致發酵速率及風味物質含量發生變化，進而影響了發酵液的風味值[24]。在接種量為4%時，貝肉酶解液的游離氨基態氮含量達到最高值(2.71±0.13)，但在增加或降低接種量時，游離氨基態氮含量都將會降低，這可能因為接種量的不足或過多，導致相應微生物代謝不足或自身生長消耗游離氨基態氮過多。相關研究也證實了適宜的接種量有利于微生物的生長，加快發酵的進程[25]。因此綜合考慮風味值和游離氨基態氮2項指標的變化情況，選取最佳接種量為4%。

圖2 接種量對發酵液風味值及游離氨基態氮含量的影響

Fig.2 Effect of seeding amount on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

2.3 發酵溫度

發酵溫度對貝肉發酵風味值及游離氨基態氮含量的影響見圖3。

圖3 發酵溫度對發酵液風味值及游離氨基態氮含量的影響

Fig.3 Effect of temperature on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

由圖3可知，隨著發酵溫度的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風味值呈現先增加后降低的趨勢，在發酵溫度為32 ℃時，貝肉酶解液的風味值達到最高值(71.05±0.48)，但在增加或降低發酵溫度時，風味值都會降低。而發酵液中游離氨基態氮的含量卻隨著溫度的升高而增加，在發酵溫度為32 ℃時，貝肉酶解液的游離氨基態氮含量達到最高值(3.62±0.09) g/L。這是因為溫度可影響微生物的新陳代謝，升高溫度有利于發酵的進行，但在發酵溫度達到34 ℃時，可能由于溫度過高導致根霉等雜菌的過度生長，產生刺激性氨味[7]，風味值大幅下降，因此綜合考慮風味值和游離氨基態氮2項指標的變化情況，選取最佳發酵溫度為32 ℃。

2.4 發酵時間

發酵時間對貝肉發酵液風味值及游離氨基態氮含量的影響見圖4。由圖4可知，隨著發酵時間的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風味值呈現先增加后降低的趨勢。在發酵時間為80 h時，貝肉酶解液的風味值達到最高值(73.11±1.13)，在增加或縮短發酵時間時，風味值都將有所降低。但隨著發酵時間的增大，游離氨基態氮含量卻呈上升趨勢，但在80 h后，游離氨基酸含量上升幅度不再隨時間的增加而大幅增大。因此綜合考慮風味值和游離氨基態氮2項指標的變化情況，且提高發酵效率的情況下，選取最佳發酵時間為80 h。

圖4 發酵時間對發酵液風味值及游離氨基態氮含量的影響

Fig.4 Effect of time on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

2.5 正交實驗優化合浦珠母貝肉酶解液發酵工藝

在單因素試驗的基礎上，選擇對試驗有較大影響的菌種比(A)、接種量(B)、發酵溫度(C)、發酵時間(D)4個因素為考察因子，進行L9(34)正交試驗，以合浦珠母貝肉發酵液的風味值和游離氨基態氮含量為評價指標，試驗結果和方差分析表3、表4所示。

由表3和表4可知菌種比(A)、接種量(B)、發酵溫度(C)、發酵時間(D)對合浦珠母貝肉發酵液的風味值和游離氨基態氮含量都有不同程度的影響。以上4個因素對發酵液的風味值的影響程度順序為菌種比例>接種量>發酵時間>發酵溫度，發酵時間和溫度對發酵液的風味值影響不顯著。

表3 發酵工藝優化正交試驗結果與分析

表4 正交試驗結果方差分析

注：“*”表示顯著影響。

以產品收集率為指標通過K值判斷可知，最優條件組合A2B3C2D3。4個因素對游離氨基態氮含量的影響程度的順序為菌種比例>發酵溫度>接種量>發酵時間，發酵溫度和發酵時間對游離氨基態氮含量的影響不顯著。以發酵液的游離氨基態含量為指標通過T值判斷可知，最優組合為A2B2C2D2。分別在2組最優組合下進行驗證實驗，在A2B2C2D2條件下發酵液的風味值及游離氨基態氮含量都高于A2B3C2D3。因此最終選取最佳發酵優化工藝為A2B2C2D2，即菌種比例1∶2、接種量4%、發酵溫度32 ℃、發酵時間80 h。

3 結論

該研究在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗設計優化合浦珠母貝肉酶解液的發酵工藝，分別考察菌種比、接種量、發酵溫度和發酵時間4個因素對合浦珠母貝肉發酵液的風味值和游離氨基態氮含量的影響，通過統計分析及對比，確定最優的發酵工藝。在4因素3水平的正交實驗基礎上確定合浦珠母貝肉酶解液的最佳發酵工藝條件為：菌種比例(1∶2)、接種量4%、發酵溫度32 ℃、發酵時間80 h，在此條件下，所得發酵液的風味值評分為96.77，游離氨基態含量為2.83 g/L。該研究結果對以合浦珠母貝肉為原料開發海鮮調味品及調味基料過程中風味改良具有重要作用，今后可進一步開展以合浦珠母貝肉酶解液來源開發的海鮮調味品與調味基料風味穩定性的研究，以提升合浦珠母取珠后貝肉綜合利用率，對我國海水珍珠產業綠色發展起到積極促進作用。