酒酒球菌(Oenococcus oeni)產胞外聚合物培養基的優化及其抗冷凍干燥性能評價

王繼鋒，石侃，安瑋，余東亮,4，劉樹文,2,3*，何玲

1(西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌，712100) 2(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌，712100) 3(陜西省合陽葡萄試驗示范站，陜西 渭南，715300) 4(秦皇島金士國際葡萄酒莊有限公司，河北 昌黎，066600) 5(西北農林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌，712100)

葡萄酒主要經歷2個發酵過程：酒精發酵(alcohol fermentation, AF)和蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation, MLF)[1]，其中蘋果酸-乳酸發酵是由酒酒球菌主導進行，有降低酸度、改善風味、增加生物穩定性的作用[2-3]。自然蘋果酸-乳酸發酵的葡萄酒由于多種微生物共同作用，可能存在生物胺含量過高、揮發酸含量過高等問題[4-5]。為了避免這些問題，可在生產過程中使用酒酒球菌發酵劑[6-7]。冷凍干燥是制備酒酒球菌發酵劑的常用方法，但菌體容易受到損傷而導致活力下降[8-9]，若在冷凍干燥過程中添加冷凍干燥保護劑則能有效降低菌體損傷，維持活力[10]。目前，我國關于酒酒球菌發酵劑及其冷凍干燥保護劑的研究較少，且過度依賴進口發酵劑，因此研究冷凍干燥保護劑對酒酒球菌發酵劑的發展有重要意義。

許多微生物在生長代謝過程中都能分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)，研究顯示，EPS可以提高微生物在逆境中的抗性[11]。某些微生物自身產生的EPS能顯著提高其對反復冷凍的抗性[12-14]。KIM等[15]從北極分離得到的細菌Pseudoalteromonaselyakovii所產的EPS能顯著提高大腸桿菌的冷凍抗性。酒酒球菌產EPS可以增加葡萄酒香氣種類，并能明顯提高細菌的逆境抗性[16]，具有成為冷凍干燥保護劑的潛力[17-18]。EPS的形成受到許多因素的影響，包括碳源、氮源、初始pH等[19-20]，不同的碳氮組合顯著影響細菌EPS的產量[21]，且不同的乳酸菌產EPS所需條件具有菌株依賴性[22]。

本研究從實驗室保藏的優良釀酒菌株中篩選得到1株高產EPS的酒酒球菌，針對該菌株產EPS的培養基條件進行優化，以提高EPS的產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

酒酒球菌(Oenococcusoeni)28A-1,西北農林科技大學葡萄酒學院微生物實驗室保藏。

1.1.2 培養基

ATB培養基的制備參照參考文獻[23]。

1.2 方法

1.2.1 酒酒球菌活化

取-80 ℃保藏的菌株接入ATB培養基，在26 ℃培養箱中培養48 h，轉接2次，待用。

1.2.2 EPS提取及產量測定

參照DIMOPOULOU等[24]的方法操作，稍有改動。將培養2周的菌液離心(8 000×g，10 min)取上清，加入3倍體積95%的乙醇在4 ℃冰箱中存放過夜，離心(8 000×g，10 min)取沉淀，冷凍干燥獲得酒酒球菌EPS。采用重量法測定EPS產量。

1.2.3 培養基條件對酒酒球菌EPS產量的影響

分別改變1.1.2中ATB培養基的pH值(3.8、4.3、4.8、5.3、5.8)，氮源種類(胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨和牛肉膏)及碳源種類(木糖、乳糖、蔗糖、果糖和葡萄糖)，將1.2.1活化后的酒酒球菌以4%接種量接種于不同培養條件的培養基中，按照1.2.2的方法測定酒酒球菌EPS的產量。選取最優氮源和碳源后，研究氮源含量(5、10、15、20、25 g/L)和碳源含量(5、10、15、20、25 g/L)對酒酒球菌EPS產量的影響。

培養基中的初始pH值、葡萄糖含量和蛋白胨含量對酒酒球菌生長代謝有重要影響，只有3者達到最適條件才能使酒酒球菌的活力達到最佳，EPS的產量達到最大。因此，以單因素試驗中最優的初始pH、葡萄糖含量和蛋白胨含量進行對EPS產量影響的L9(33)正交試驗，按照1.2.2的方法測定酒酒球菌EPS的產量，確定3個因素的最優組合。

1.2.4 冷凍干燥存活率

具體參照ZHAO等[17]的方法操作，稍有改動。取10 mL培養至穩定期的菌液離心(8 000×g，10 min)去上清，用無菌生理鹽水洗滌2次。加入冷凍干燥保護劑1 mL混勻，于-80 ℃冰箱過夜后放入真空冷凍干燥機處理24 h，溫度為-55 ℃，真空度<0.06 mbar。真空冷凍干燥前后活菌數采用平板計數法檢測，如公式(1)。

(1)

式中：Nf,真空冷凍干燥后菌懸液活菌數,CFU/mL;N0,真空冷凍干燥前菌懸液活菌數,CFU/mL。

1.2.5 冷凍干燥保護劑對酒酒球菌抗冷凍干燥能力的影響

參考張國強[25]的方法操作，確定將質量分數為10%蔗糖、10%甘露糖、10%海藻糖、10%葡萄糖、10%乳糖、5%酵母浸粉、5%甘露醇、5%EPS、2.5%谷氨酸鈉和1.1.2中的ATB培養基分別作為冷凍干燥保護劑，加入離心洗滌后的菌泥中，以水作為對照組，按照1.2.4的方法檢測酒酒球菌冷凍干燥存活率。

1.2.6 場發射掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察

通過場發射掃面電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察冷凍干燥前后酒酒球菌細胞表面的變化。冷凍干燥前的樣品需離心(8 000×g，10 min)以收集穩定期前期的酒酒球菌，用無菌水洗滌3次，懸浮在體積分數為2.5%的戊二醛中,4 ℃隔夜固定后用2 mL 0.1 mol/L的PBS(pH 6.8)緩沖液浸洗4次，每次10 min。浸洗完成進行細胞脫水，用體積分數為10%、30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液各浸1次，每次15～20 min，最后用100%的乙醇浸3次，每次30 min。接著干燥細胞4 h，噴金后使用掃描電子顯微鏡(Nova Nano SEM-450 美國)進行觀察。冷凍干燥后的樣品可直接噴金進行觀察，無需前處理。

通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察冷凍干燥前后酒酒球菌細胞內部的變化。所有樣品在脫水之前(包括脫水)的操作與TEM一致，脫水后將細菌懸浮在白膠∶乙醇(1∶1)中過夜后懸浮在白膠中處理2次，分別為3和6 h。在60 ℃條件下固定48 h，進行切片，染色，最后使用透射電子顯微鏡(TECNAI G2 SPIRIT BIO美國)進行觀察。

1.3 數據處理

試驗結果采用SPSS 20.0 分析軟件(上?？ㄘ愋畔⒓夹g有限公司)進行分析。

2 結果與分析

2.1 培養基條件對酒酒球菌EPS產量的影響

培養基初始pH值、碳源、氮源對微生物生長及產物代謝均有重要的影響，對其進行優化可以顯著提高目標代謝產物產量。

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 初始pH

酒酒球菌是一種耐受低酸環境的細菌，能夠在葡萄酒酒精發酵后的低酸環境中進行MLF[15]。因此，將初始pH值控制在3.8～5.8。由圖1可知，酒酒球菌EPS產量隨著初始pH值的升高先升高后降低，且當初始pH值為4.3時，EPS產量最高(96.3 mg/100 mL)。說明優化初始pH值能明顯提高酒酒球菌EPS的產量。在其他乳酸菌產EPS的研究中，干酪乳桿菌在初始pH值為6.5時產生的EPS量比其他試驗組有明顯提高[26]，同樣德氏乳桿菌在不同的初始pH值下所產生EPS的量也有明顯差異[27]。

圖1 初始pH值對酒酒球菌EPS產量的影響

Fig.1 Effects of initial pH value on EPS production of Oenococcus oeni

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.1.2 氮源種類及氮源含量

氮元素作為構成蛋白質和核酸的主要元素之一，是微生物生長的必需因素。胰蛋白、大豆蛋白、蛋白胨和牛肉膏作為酒酒球菌生長所需氮源對EPS產量的影響見圖2-a。

當ATB培養基中的氮源是蛋白胨時，酒酒球菌EPS的產量明顯高于其他氮源，可以達到97 mg/100 mL。培養基的氮源種類不同，酒酒球菌EPS的產量有明顯差異，可能是由于蛋白胨中的氨基酸、短肽或其他因素更適合酒酒球菌，對酒酒球菌生成EPS有明顯的影響，但是蛋白胨的含量是否對酒酒球菌EPS的產量有影響還需要研究。

根據酒酒球菌常用培養基中的氮源含量，設定了5～25 g/L的梯度進行試驗，由圖2-b可知，酒酒球菌EPS產量隨著蛋白胨含量升高先升高后降低，說明蛋白胨含量過高或過低都會減少酒酒球菌EPS的產量，且當蛋白胨含量為20 g/L時，EPS產量最高(109.7 mg/100 mL)。說明ATB培養基中選擇合適的蛋白胨含量能明顯提高酒酒球菌EPS的產量。該結果與KANMANI等[28]研究乳酸鏈球菌EPS的產量時最優氮源含量的結果一致。

圖2 氮源種類(a)及氮源含量(b)對酒酒球菌EPS產量的影響

Fig.2 Effects of nitrogen source (a) and peptone (b) on EPS production of Oenococcus oeni

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.1.3 碳源種類及碳源含量

碳源作為營養成分的一種，是影響菌體EPS產量的重要因素之一[29]。本研究選取培養基中常用的碳源以相同的含量進行試驗，結果由圖3-a可知，當ATB培養基中的碳源是葡萄糖時，酒酒球菌EPS的產量明顯高于其他碳源，達到95.6 mg/100 mL。培養基中的碳源種類不同，酒酒球菌EPS的產量有明顯差異，說明碳源種類對酒酒球菌生成EPS有明顯的影響，但是碳源的含量是否對酒酒球菌EPS的產量有影響還需要試驗。故選取葡萄糖作為碳源，研究其含量對酒酒球菌EPS產量的影響。

圖3 碳源種類(a)及碳源含量(b)對酒酒球菌EPS產量的影響

Fig.3 Effects of carbon source (a) and glucose (b) on EPS production of Oenococcus oeni

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

由圖3-b可知，酒酒球菌EPS產量隨著葡萄糖含量升高先升高后降低，說明葡萄糖含量過高或過低都會減少酒酒球菌EPS的產量，且當葡萄糖含量為15 g/L時EPS產量最高(103.1 mg/ 100 mL)。說明ATB培養基中合適的葡萄糖含量能明顯提高酒酒球菌EPS的產量。

2.1.2 正交試驗對酒酒球菌EPS產量的影響

選取單因素產量最高的初始pH、蛋白胨含量和葡萄糖含量進行L9(33)正交試驗，測定各因素對結果的影響大小，并選取最優培養基條件。由表1可知，酒酒球菌EPS產量影響因素的主次順序為B>A>C，即蛋白胨含量>初始pH>葡萄糖含量。由K值可以確定生產條件的最佳組合為A3B2C2，即初始pH值4.8、蛋白胨含量20 g/L、葡萄糖含量15 g/L，此時酒酒球菌能夠生產119.7 mg/100 mL EPS，高于其他試驗組。本試驗結果明顯高于DIMOPOULOU等[24]研究中酒酒球菌在未優化培養基中EPS的產量，對其他乳酸菌EPS產量的研究中發現正交試驗能夠顯著提高EPS的產量[30]。說明正交試驗優化對酒酒球菌EPS的產量有明顯的提升作用。

用SPSS 20.0統計軟件對正交試驗結果進行方差分析見表2，因素A和B在P<0.05的水平上有顯著性差異。

表1 正交試驗對酒酒球菌EPS產量的影響

表2 正交試驗方差分析結果

注：*差異顯著(P<0.05)。

2.2 EPS抗冷凍干燥

2.2.1 冷凍干燥存活率試驗

由圖4可知，對照組(水)冷凍干燥酒酒球菌存活率為5.2%，添加保護劑試驗組的酒酒球菌冷凍干燥存活率顯著高于對照組，且不同保護劑的保護效果有明顯差異。保護效果最好的4種保護劑是:10%蔗糖、10%海藻糖，、5%EPS、2.5%谷氨酸鈉，存活率分別為49.62%、54.89%、70.97%和68.50%，此結果與張國強[25]的經2.5%谷氨酸鈉、10%海藻糖、10%蔗糖及其他冷凍干燥保護劑凍干酒酒球菌后的存活率相近。

圖4 不同冷凍干燥保護劑對酒酒球菌冷凍干燥存活率的影響

Fig.4 Effects of different freeze-drying protectant on survival rate of Oenococcus oeni after freeze drying

為了進一步研究4種保護效果最好的保護劑添加量對冷凍干燥存活率的影響，分別添加質量分數為5%、10%、15%、20%和25%的蔗糖和海藻糖；質量分數為0.5%、2.5%、5%、7.5%和10%的EPS和谷氨酸鈉進行單一保護劑添加量的試驗。

通過表3可以看出，保護劑的添加量對酒酒球菌冷凍干燥存活率影響明顯，且各試驗組的存活率均隨著保護劑添加量的增加先升高后下降，當蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和EPS的質量分數分別為15%、10%、2.5%和5%時酒酒球菌存活率最高，分別達77.46%、56.72%、67.17%和73.31%。其中蔗糖在濃度優化后，其保護效果明顯高于優化前，其余各保護劑的最優濃度與單因素試驗結果相近。

表3 冷凍干燥保護劑添加量對酒酒球菌冷凍干燥存活率能力的影響

2.2.2 SEM和TEM觀察結果

本試驗通過SEM和TEM觀察酒酒球菌不同處理下細胞內部和表面的變化，以期得到EPS冷凍干燥保護的機制。選擇同為糖類且冷凍干燥存活率與EPS相當的蔗糖以及水作為對照，與EPS進行比較。

比較圖5第1列發現，添加EPS試驗組冷凍干燥后樣品(圖5-A1)呈一定厚度的片狀物，表面無細胞暴露，這與蔗糖試驗組(圖5-B1)的結果相一致；添加水冷凍干燥后的樣品(圖5-C1)也呈片狀但表面有大量暴露在外且被壓縮成薄片的細胞，還有呈石榴狀的細胞團[35]，可能是這些“石榴”及“薄片”中心的細胞由于周圍細胞的保護得以幸存，而位于“石榴”和“薄片”周圍的細胞大量死亡，這也解釋了冷凍干燥存活率試驗中添加水的試驗組存活率低的原因。

比較圖5第2列發現添加EPS試驗組(圖5-A2)中拍攝到EPS的斷裂層，細胞被EPS包裹如同鑲嵌在EPS中，細胞表面光滑無褶皺，EPS斷層表面有許多凹洞，每1個凹洞形狀規則表面光滑，可能是片狀物斷裂后細胞掉落形成的。蔗糖實驗組(圖5-B2)與EPS試驗組相似，但是有部分細胞有破裂現象，可能是由于蔗糖在結晶過程中會不斷長大[36]導致部分細胞受到蔗糖晶體的機械損傷而破裂。在添加水的對照組(圖5-C2)中可以發現“薄片”中有大量堆積在一起被壓縮的細胞，圖片中央的“石榴”表面的細胞有破損，且左下角有不規則的細胞，可能是破裂后的細胞。

比較圖5第3、4列可以發現添加EPS試驗組(圖5-A3、圖5-A4)中的細胞被EPS包裹，所有的細胞形態完整，未發生細胞壁破損的現象。蔗糖試驗組(圖5-B3、圖5-B4)結果與EPS類似，但包裹細胞的保護層更薄。添加水的對照組(圖5-C3、圖5-C4)中的細胞有明顯破裂，大量細胞內容物外泄，能看到許多細胞碎片細胞外圍有少許物質包裹，推測可能是細胞產生的EPS，但產量過低，不能完全包裹細胞。

A-添加EPS的試驗組；B-添加蔗糖的試驗組；C-添加水的對照組；1、2列-SEM圖像；3、4列-TEM圖像

圖5 不同處理下冷凍干燥后SEM和TEM的圖像

Fig.5 The image of SEM and TEM under different processing after freeze-drying

3 結論

本試驗通過酒酒球菌產EPS培養基條件的優化的研究發現，優化后的培養基能夠顯著提高酒酒球菌EPS的產量，并且含EPS的冷凍干燥保護劑對酒酒球菌冷凍干燥存活率有明顯的提升作用，說明該保護劑能夠作為高效酒酒球菌冷凍干燥保護劑。

試驗結果顯示，酒酒球菌EPS生產的最適碳源是葡萄糖，最適氮源是蛋白胨，且酒酒球菌EPS的產量隨著初始pH、蛋白胨含量和葡萄糖含量的增加先升高后降低，在初始pH值為4.3時EPS產量最高(96.3 mg/100 mL)，葡萄糖含量為15 g/L時EPS的產量最高(103.1 mg/100 mL)，蛋白胨含量為20 g/L時EPS產量最高(109.7 mg/100 mL)。通過正交試驗優化可得在初始pH值4.8、蛋白胨含量20 g/L、葡萄糖含量15 g/L的條件下，能夠生產119.7 mg/100 mL酒酒球菌EPS。酒酒球菌冷凍干燥存活率的研究結果表明，保護效果最好的4種保護劑是15%蔗糖、10%海藻糖、5%EPS、2.5%谷氨酸鈉，存活率分別為77.46%、56.72%、73.31%和67.17%。SEM和TEM的結果表明酒酒球菌EPS有冷凍干燥保護作用，能使細胞內部和外表面的形態保持完整。后續研究中，可繼續深入探究EPS冷凍干燥保護的機理，以及EPS的組成和分子結構，幫助研究者了解EPS。