外源性cAMP對糙皮側耳原基形成的影響

張夢珂 戚元成 文 晴 邱立友 申進文

（河南農業大學生命科學學院，河南鄭州450002）

糙皮側耳（Pleurotus ostreatus），又稱平菇，廣泛分布于世界各地，其肉質肥厚、味道鮮美，具有較高的營養價值和藥用價值[1]。平菇經擔孢子萌發形成單核菌絲，單核菌絲接合而成雙核菌絲，當環境條件適宜時，雙核菌絲扭結形成原基進而發育成熟形成子實體[2-3]。糙皮側耳雙核菌絲誘發形成原基進而發育成熟為子實體受到各種環境因素的影響，如光、溫度、濕度、二氧化碳[4]和培養料碳氮比，這些條件共同作用誘導菌絲體形成原基發育成子實體，但原基誘發和子實體的發育機制還沒有得到完全解析。

環磷酸腺苷（cAMP）作為信號轉導途徑中的“第二信使”[5]，在原核及真核細胞中均有發現，響應多種胞外刺激，調節生物生長發育[6]。在生物體內，cAMP誘導的真核基因表達與蛋白激酶A（PKA）的激活緊密相關，一方面cAMP水平的升高可以激活PKA，另一方面PKA又可以磷酸化某些特定的轉錄因子，促進cAMP誘導的基因表達[7]。敲除裂褶菌蛋白激酶A（PKA）和腺苷酸環化酶編碼基因，能引起突變株的子實體產量降低或子實體發育異常。cAMP信號涉及真菌的很多細胞過程，如細胞生長、新陳代謝、形態發生、脅迫響應和病原真菌的侵染能力等[8]。在擔子菌中，cAMP可以誘導灰蓋鬼傘的單核體菌株產生子實體，阻止cAMP的合成延緩雙核菌絲體扭結形成原基，以高濃度的葡萄糖抑制cAMP的累積從而抑制原基的產生[9]。研究通過分析外源性cAMP對糙皮側耳菌絲生長及原基形成的影響，旨在為進一步從分子水平解析糙皮側耳原基形成過程中cAMP的作用機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

糙皮側耳新831，由河南農業大學生命科學學院應用真菌實驗室保藏。

蔗糖天冬酰胺合成培養基（SA，固體培養基）：蔗糖 20 g，天冬酰胺 0.88 g，磷酸二氫銨 2.0 g，L-纈氨酸1.0 g，三水磷酸氫二鉀0.224 g，磷酸二氫鉀0.803 g，七水硫酸鎂0.99 g，氯化鈣0.02 g，微量元素溶液5 mL，維生素核苷酸溶液5 mL，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL。微量元素溶液：七水硫酸鋅0.89 g，硫酸錳0.765 g，檸檬酸鐵0.73 g，五水硫酸銅0.20 g，蒸餾水1000 mL。維生素核苷酸溶液：腺苷1.60 g，維生素B10.02 g，蒸餾水1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度的cAMP對糙皮側耳菌絲生長及原基形成的影響

將外源添加藥品按添加濃度現用現配，過濾除菌后備用，添加濃度 0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L，SA培養基融化冷卻到約60℃時，加入相應濃度cAMP混勻后制平板。將活化后的新831菌絲，用打孔器打取直徑5 mm的邊緣菌絲塊，菌絲正面朝上接入制備好的固體平板培養基中央，在25℃恒溫培養箱避光培養。待某個處理的菌絲滿板時，測定糙皮側耳菌絲生長速度，隨后10℃恒溫培養箱光照黑暗交替（8 h光照、16 h黑暗）培養18 d，記錄原基形成情況（拍照），并測定相應蛋白濃度。每個濃度10個板，三次重復。

1.2.2 菌絲平均長速的測定

參照1.2.1生物接種方法接種，25℃恒溫培養箱避光培養，待某個處理的菌絲滿板時即結束培養。通過十字交叉法測定菌絲生長長度（mm），并計算出菌絲平均生長速度。

菌絲平均生長速度（mm/d）=菌絲生長長度（mm）/培養天數（d）

1.2.3 蛋白濃度的測定

蛋白含量測定原理：蛋白質中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸可與考馬斯亮藍G250染料結合，使考馬斯亮藍G250染色液由黑棕色變為藍色，并且生成的藍色產物在595 nm處有最大吸收峰值。因此，通過測定反應液的OD595值，并帶入蛋白濃度標準曲線即可計算出溶液中的蛋白濃度。

（1）蛋白濃度標準曲線的制作方法：根據蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）的操作說明測定不同蛋白濃度下的OD595值，如表1所示。

表1 蛋白濃度標準曲線繪制

（2）蛋白濃度測定方法：取5 μL待測液至酶標管內，之后加入200 μL考馬斯亮藍G250染色液，室溫放置10 min，測定OD595值。將OD595值代入蛋白標準曲線所示標準曲線公式中，計算出待測液中的蛋白濃度。

1.2.4 cAMP對糙皮側耳PKAC-1和PKAC-2基因表達量的影響

根據上述試驗結果，選取cAMP1mmol/L的添加濃度制備平板，同時把cAMP 0mmol/L作為空白對照，將糙皮側耳新831接種于平板中央。培養條件：25℃恒溫培養箱避光培養，待菌絲滿板，隨后10℃恒溫培養箱光照黑暗交替（8 h光照、16 h黑暗）培養4 d、8 d、12 d、16 d、20 d，每個培養時間3個板，三次重復。Trizol法提取不同時間總RNA，取1 μg總RNA樣品，參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA的第一條鏈，選取糙皮側耳actin為內參基因，參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明，實時熒光定量分析在不同培養時間添加cAMP與空白對照組糙皮側耳PKAC-1和PKAC-2的差異表達。qRT-PCR反應體系為：10 μL SYBR Green Master Mix，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），1 μLcDNA，7.4 μL ddH2O。循環參數設定為：95℃預變性3 min；95℃30 s，60℃25 s，共40個循環，3次重復。反應在applied 7500實時熒光定量PCR儀上進行，利用2-ΔΔCT的方法計算目的基因相對表達量。試驗所需引物如下：PKAC-1熒光定量-F TCTGTCGATCCCCAAATGCC，PKAC-1熒光定量-R GCGTACCCTTGACCTCGAAA，PKAC-2熒光定量-FATTGTTCACGCTGCTACGGA，PKAC-2熒光定量-RTCAGGCTTGAGGTCCCGATA。

試驗數據用SPSS 16.0統計分析軟件進行單因素方差分析（LSD，P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度cAMP對糙皮側耳（新831）菌絲長速的影響

不同cAMP濃度對糙皮側耳菌絲平均長速的影響見圖1。在測試濃度范圍內，隨著cAMP濃度的增加，糙皮側耳菌絲平均長速先快后慢，cAMP添加濃度為1 mmol/L時菌絲平均長速達到最大值，cAMP添加濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L能顯著提高糙皮側耳菌絲平均生長速度（P＜0.05），添加cAMP濃度繼續升高，對菌絲生長出現抑制作用，但抑制效果不顯著。

圖1 不同濃度cAMP對糙皮側耳（新831）菌絲長速的影響

2.2 不同濃度cAMP對糙皮側耳（新831）原基形成的影響

不同cAMP濃度對糙皮側耳（新831）菌絲原基形成的影響見圖2。10℃恒溫培養箱光照黑暗交替（8 h光照、16 h黑暗）培養18 d后，未添加cAMP的空白對照組，未見原基形成；cAMP添加濃度為1 mmol/L時明顯可見原基形成；添加濃度為2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L時，平板中可見菌絲扭結，且隨著添加濃度的升高，菌絲扭結越少；其他cAMP添加濃度與對照組沒有差異。

圖2 不同濃度cAMP對糙皮側耳（新831）菌絲原基形成的影響

2.3 不同濃度cAMP對糙皮側耳（新831）菌絲蛋白含量的影響

將上述1.2.1所得添加不同濃度cAMP培養基培養菌絲，按照蛋白濃度測定方法，測定菌絲蛋白含量。結果表明，在試驗濃度范圍內，與空白對照組相比，cAMP顯著降低糙皮側耳菌絲的蛋白含量（P＜0.05）；cAMP添加濃度為1 mmol/L時，菌絲蛋白含量最低；cAMP添加濃度為2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L時，菌絲蛋白含量略微提高，但仍顯著低于空白對照組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同濃度cAMP對糙皮側耳（新831）菌絲蛋白含量的影響

2.4 外源性cAMP對糙皮側耳（新831）PKAC-1和PKAC-2表達量的影響

由圖4可見，與對照組相比PKAC-1相對表達量整體下調，其中培養4 d后PKAC-1相對表達量下調顯著（P＜0.05），其他與對照組之間不存在顯著性差異；培養時間8 d、12 d、20 d時，加cAMP組與不加cAMP相比PKAC-2的相對表達量整體上調，且在培養12 d時cAMP顯著提高PKAC-2的相對表達量（P＜0.05）。

圖4cAMP對PKAC-1、PKAC-2相對表達量的影響

3 小結與討論

研究結果表明，cAMP對糙皮側耳（新831）菌絲生長影響顯著，適宜濃度的外源cAMP顯著促進糙皮側耳菌絲生長，但高濃度的外源cAMP抑制菌絲生長，cAMP對糙皮側耳菌絲生長的影響與對其他一些真菌的效應相同。2007年，HU等發現較高濃度的外源cAMP抑制水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani AG－1IA分離物的菌絲生長[10]。OLIVER等2002年發現高濃度的外源cAMP抑制致病真菌煙曲霉Aspergillus fumigatus的菌絲生長[11]。

cAMP添加濃度1 mmol/L能顯著縮短光誘導糙皮側耳（新831）原基形成所需時間。綠色木霉中的光誘導伴隨著細胞內cAMP水平的突然短暫升高[12]，磷酸二酯酶抑制劑對光誘導的分生孢子形成有促進作用[13]。1998年，NEMCOVIC等發現cAMP在調節木霉菌分生孢子形成過程中起著關鍵作用[14]。對白色念珠菌的研究發現，刺激腺苷酸環化酶生成cAMP能誘導其菌絲形態發育，腺苷酸環化酶等位基因極度活躍或外源cAMP的添加能促進白色念珠菌菌絲發育[15]，而腺苷酸環化酶缺失菌株（cyr1△）在菌絲發育方面存在缺陷[16]，說明cAMP對于白色念珠菌的菌絲發育必不可少[17]。

2006年，ALFREDO等對綠色木霉的研究發現，在綠色木霉的分生孢子形成過程伴隨著PKA活性的升高[18]。實時熒光定量PCR分析cAMP添加后糙皮側耳（新831）PKAC-1和PKAC-2基因在不同培養時間的差異表達結果表明，添加cAMP對糙皮側耳PKAC-1和PKAC-2基因的表達量有一定影響，處理組與對照組相比，PKAC-1表達量差異不顯著，但PKAC-2表達量在培養12 d時顯著上調，表明cAMP可能通過上調PKAC-2基因的表達量來提高蛋白激酶活性，從而加速原基形成。

添加外源cAMP對糙皮側耳原基的形成可能起到了一定作用，研究結果對探究糙皮側耳原基形成的分子機制提供了一定的理論基礎。