香菇液體深層發酵優化研究

韓 冰 陳 順 于廣峰 王洪奇 冀寶營 孫立梅 關艷麗 郭玲玲

（遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000）

香菇（Lentinus edodes）隸屬于擔子菌綱傘菌目口蘑科香菇屬，又名香菇菌、花菇、花蕈等，是目前我國生產量和消費量最大的食用菌品種之一[1]，也是世界著名食藥用真菌，居全球食用菌產量第二位。2015年，中國香菇產量達767萬t，占全球香菇總量的90%以上[2]。我國是世界上最早認識和栽培香菇的國家之一，至今已有800多年的歷史[3]。

相對于固體菌種而言，液體菌種生產有工藝簡便、周期短、菌種純、成本低等特點[4]，目前采用液體菌種栽培的食用菌已有50余種[5]。香菇作為食用菌生產的支柱產業之一，其液體種的生產工藝是提高香菇生產效率的關鍵。筆者以遼西地區主栽香菇品種遼香6號為供試品種，對其深層發酵條件進行研究，以期為香菇液體菌種的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇菌株“遼香6號”，原種由遼寧省微生物科學研究院食用菌栽培研究室保藏。

1.2 試驗設備及培養基原材料

（1）主要儀器：上海舜宇恒平電子天平（MP2002型）、申安立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-75KB型）、超凈工作臺、中器生化培養箱（SPX-450型）、上海世平立式雙層大容量恒溫培養搖床（SPH-2102型）、Sigma離心機（3K15型）等。

（2）培養基原材料：葡萄糖、蔗糖、紅糖、瓊脂、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、KH2PO4、Mg SO4·7H2O、玉米面、麩皮、木屑、石膏等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的制備與培養料的配制

1.3.1.1 供試菌種活化

在無菌條件下，將母種菌絲接種至PDA斜面上，25℃下培養7 d后挑選菌絲濃密、潔白、健壯的試管作為供試菌種。

1.3.1.2 液體菌種的制備

將每塊0.5 cm2大小的3塊菌絲塊接種至含100 m L供試液體培養基（基礎培養基土豆10%，玉米面1%，葡萄糖1%，麩皮4%，KH2PO40.2%，Mg-SO4·7H2O 0.1%）的500 mL三角瓶中，25℃搖床培養，轉速150 r/min。

1.3.2 液體菌種培養基配方的碳源、氮源篩選試驗

1.3.2.1 碳源的篩選

以原有培養基配方（1.3.1.2）為基礎，進行碳源的篩選，用2%玉米粉分別與1%的葡萄糖、蔗糖、紅糖組合作為碳源，添加麩皮4%，KH2PO40.2%，Mg-SO4·7H2O 0.1%配制液體培養基；25℃，150 r/min條件下培養，每種培養基3個重復。測定菌絲生物量，求平均值，篩選出最佳碳源組合。

1.3.2.2 氮源的篩選

以碳源試驗篩選出優勢碳源組合為氮源的篩選試驗培養基碳源，以2%麩皮分別與1%的酵母粉、蛋白胨、牛肉粉組合作為氮源（添加玉米面2%，葡萄糖 1%，麩皮 2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%）配制培養基，每種培養基3個重復。測定菌絲生物量，求平均值，篩選出最佳氮源組合。

1.3.3 液體培養條件優化試驗

以篩選出的最適培養基配方（玉米粉2%，紅糖1%，麩皮 2%，酵母粉 1%，KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%）液體培養條件優化試驗，裝量為每瓶100 mL，pH自然，接種斜面菌種，25℃恒溫培養。以搖床轉速、接種量和靜置時間為因素，設計正交試驗（表1），以菌絲生物量（濕重）為考察指標，確定香菇液體菌種培養條件的最優組合。

上述試驗取發酵液各3瓶，9193×g離心10 min，棄殘液，稱重，得菌絲生物量，取平均數。

1.3.4 液體菌種接種培養料試驗

選1%紅糖和葡萄糖這兩種優勢碳源，分別與1%牛肉粉、蛋白胨和酵母粉組合，添加玉米粉2%，麩皮2%，KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%為培養基制備香菇液體菌種，以斜面固體菌種為對照，分別接入固體培養料。液體菌種接種5 mL，每個配方接種5瓶；固體種接入長2 cm斜面菌種2～3塊。

接種后23℃恒溫培養，每隔24 h觀測液體菌種和斜面固體菌種在培養料上菌絲萌發情況，記錄菌絲滿瓶所需時間，測量培養料的高度，計算菌絲的平均生長速度（菌絲長速=培養料的高度/菌絲滿瓶所需時間），觀察并計算污染率。

表1 香菇液體菌種培養條件正交試驗的因素與水平

1.3.5 液體菌種最佳發酵時間的確定

以篩選出的最適培養基配方、最適的液體培養條件培養液體菌種，培養5 d后每隔24 h取樣轉接3支試管，觀察菌種萌發及滿管時間，同時取樣3瓶測定菌絲生物量，至菌絲生物量下降結束培養。

2 結果與分析

2.1 碳源組合篩選結果

試驗結果見表2。由表2可見，以1%紅糖+2%玉米粉組合碳源最好，獲得香菇菌絲生物量最高，為11.35 g/100 mL，1%葡萄糖+2%玉米粉組合次之，1%蔗糖+2%玉米粉組合最低。因此，可確定1%紅糖+2%玉米粉組合為最佳碳源組合。

表2 不同碳源組合對香菇菌絲生物量的影響

2.2 氮源組合篩選結果

試驗結果見表3。由表3可知，以氮源1%酵母粉+2%麩皮，碳源1%紅糖+2%玉米粉組合最好，獲得香菇菌絲生物量高；氮源1%牛肉粉+2%麩皮與碳源1%葡萄糖+2%玉米粉組合也能獲得較高的香菇菌絲生物量；氮源1%蛋白胨+2%麩皮與碳源1%葡萄糖+2%玉米粉組合的獲得菌絲生物量最低。因此，可確定1%酵母粉+2%麩皮，1%紅糖+2%玉米粉組合為最佳碳氮源組合，菌絲生物量為21.26 g/100 mL。

表3 不同氮源組合對香菇菌絲生物量的影響

2.3 液體菌種接種培養料結果

由從表4和圖1、2、3可見，1%牛肉粉+1%紅糖、1%酵母粉+1%紅糖、1%酵母粉+1%葡萄糖為碳氮源組合培養的液體菌種，接種固體培養料后發菌、吃料速度快，結合液體菌種培養基配方的單因素篩選結果，進一步確定1%酵母粉+1%紅糖為最優碳氮源組合。

表4 液體菌種在固體培養料上發菌情況

液體菌種為接種4 d后萌發（圖1），固體菌種未萌發，可見液體菌種萌發明顯快于固體菌種；液體菌種接種23 d后菌絲長滿培養瓶（圖2）；圖3接種90 d產生原基及子實體（圖3左、中），而固體菌種未產生原基（圖3右）。由此可見，從菌種萌發、菌絲生長到原基形成液體菌種都優于固體菌種。

2.4 液體菌種培養條件優化結果

極差分析表明（表5），極差值越大，在該因素水平變動時，對香菇菌絲體生物量的影響越大。從表5可以看出，3因素的極差值大小順序是A＞B＞C，表明試驗培養條件中影響香菇菌絲體生物量的最主要因素是搖床轉速。根據水平之間K值大小比較得知，最佳組合為A2B3C2。因此，試驗最佳的香菇液體菌種培養條件：搖床轉速150 r/min，接種4塊菌種、搖前靜置時間24 h。

圖1 液體菌種接種4 d萌發狀態

圖2 接種液體菌種菌絲滿瓶

圖3 固、液菌種接種90 d對比

表5 香菇液體菌種培養條件優化正交試驗結果

2.5 液體菌種最佳培養時間

由表6可知，發酵第8天菌絲生物量最高，發酵液黏稠，回接試管菌絲萌發較快，可確定為發酵終點。

表6 液體菌種不同發酵時間的確定

3 小結與討論

試驗確定香菇遼香6號液體培養的最適培養基配方：玉米粉2%，紅糖1%，麩皮2%，酵母粉1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%。最佳培養條件為：接種4塊菌種（每塊0.5 cm2），培養溫度25℃，上搖床前靜置24 h，搖床轉速150 r/min，以培養8 d為宜。

不同的香菇品種所需液體發酵的營養成分會有差異，需根據菌株特點和液體發酵目的進行篩選。但培養條件卻大致相同，試驗培養條件可供參考。試驗為搖瓶培養結果，對于大型發酵罐是否適宜，有待驗證。