一株多形炭角菌的分離鑒定及其生長特性研究

何山文 雷 瓊 馬立安*

（1長江大學生命科學學院，湖北荊州434025；2荊州文物保護中心，湖北荊州434020）

多形炭角菌（Xylaria polymorpha）屬于菌物界，子囊菌門，盤菌亞門，糞殼菌綱，炭角菌亞綱，炭角菌目，炭角菌科，炭角菌屬。多形炭角菌主要生長于林間腐木、樹皮裂縫中[1]。研究表明，多形炭角菌具有藥用價值[2]，是天然產物的豐富來源。JANG等[3-4]不僅從多形炭角菌子實體的甲醇提取物分離到亞油酸、亞油酸甲酯及麥角甾醇等多種生物活性物質，還分離到2種聚丙酸酯xylarinic acids A和B（具有清除自由基、抗真菌與抗炎活性）。楊寧寧等[5]從多形炭角菌菌絲發酵產物乙酸乙酯部分中分離鑒定出具有乙酰膽堿酯酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗線蟲活性的新物質。由于多形炭角菌的資源比較匱乏，難以大量收集，其大規模開發利用受到限制。

筆者對一株疑似炭角菌屬的大型野生真菌進行組織分離，并通過真核生物核糖體基因ITS序列對其進行鑒定并研究其培養特性，為其人工馴化栽培及產業發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株采自英國諾里奇東安吉利亞大學校區林間的野生大型真菌（圖1），保存于長江大學生命科學學院微生物實驗室。

供試基礎培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，去離子水1000 mL，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化

將野生菌進行酒精消毒后，取子實體部分接于PDA培養基上，28℃恒溫箱中培養，4 d后挑取邊緣菌絲轉接，轉接2～3次，經鏡檢無雜菌后即得到純化的菌株，編號為T-18。

1.2.2 形態學鑒定

將菌株接種于PDA培養基上，7 d后觀察記錄菌落特征、菌絲形態。

1.2.3 分子系統鑒定

將菌絲置于PDA液體培養基中培養3 d，離心取出菌絲后采用改良的CTAB法[6]提取DNA。PCR擴增引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，PCR 反應體系（50 μL），其體系為 10×Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，Taq（2 U/μL）1 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 33 μL，DNA模板4 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性4 min，94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環；72℃延伸10 min。0.8%的瓊脂凝膠電泳檢測后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 菌絲生長特性研究

保存的菌種接種到PDA培養基上，放入25℃恒溫培養箱培養5 d進行活化。取1 cm2左右活化菌種接種進裝有150 mL基礎培養基的三角瓶中，放置于25℃、轉速為100 r/min的溫控搖床培養5 d，制成種子液備用。

1.2.4.1 碳源對菌絲體生長的影響

以不加葡萄糖的基礎培養基為空白對照，以基礎培養基中葡萄糖的含碳量為標準，以相同含碳量的蔗糖、乳糖、麥芽糖、α-可溶性淀粉分別代替葡萄糖，共6個處理，每個處理3次重復。培養基裝液量50 mL/100 mL三角瓶，等量接種，放置于25℃、轉速為100 r/min的恒溫搖床培養7 d。培養結束后，取發酵液過濾，收集菌絲體。菌絲體于50℃烘干12 h至恒重后稱重。計算菌絲體產量（平均每100 mL發酵液得到的菌絲體干重）。

1.2.4.2 氮源對菌絲體生長的影響

以不加蛋白胨的基礎培養基為空白對照，以基礎培養基中蛋白胨的含氮量為標準，以相同含氮量的牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉分別代替蛋白胨，研究氮源對菌絲體生長的影響。共7個處理，每個處理3次重復。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.4.3 無機鹽對菌絲體生長的影響

以不加磷酸二氫鉀和硫酸鎂的基礎培養基為空白對照，選用硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鉀6種無機鹽進行試驗。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.4.4 溫度對菌絲體生長的影響

液體培養基為基礎培養基，培養溫度為15、20、25、30、35℃，共6個處理，每個處理3次重復。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.4.5 pH對菌絲體生長的影響

液體培養基為基礎培養基，pH設置為3、4、5、6、7、8、9，每個處理3次重復。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.5 數據處理

以菌絲體生物量作為指標，繪制柱狀圖。采用SPSS 19.0對試驗數據進行統計分析，用LSD法比較各因素對菌絲產量的差異顯著性影響。

圖1 樣品子實體形態

圖2 樣品菌落平板形態

圖3 ITS片段PCR產物電泳圖

2 結果與分析

2.1 樣品形態學鑒定

樣品子實體菌落形態如圖1、2所示。頭部呈橢圓形或卵圓形或近球形，飽滿肥厚，呈顆粒狀簇生在一起，表皮黑褐色、光滑，內部呈白色，有濃郁的香氣。菌絲體呈樹枝狀，由根部往上生長分出若干分枝。菌絲體表皮呈黑褐色，帶黑色斑點，末端白色，在培養基中生長時分泌出水滴狀液體。

2.2 野生菌株的ITS序列分析

PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，可見約600 bp的目的條帶，條帶明亮清晰，無拖尾，見圖3。測序獲得野生菌株的ITS區域核酸序列，共579 bp。提交至GenBank獲得基因號為KF897015。下載與其同源性較高的菌株序列作為參考，用Mega 5.1軟件構建分子系統發育樹，結果如圖4所示。與登錄號為FM164944.1的多形炭角菌（Xylaria polymorpha）的DNA序列同源性為99%。結合形態特征鑒定結果，鑒定該菌為多形炭角菌（Xylaria polymorpha），屬于炭角菌目，炭角菌科，炭角菌屬。

圖4 T-18的16 s基因序列構建的系統發育樹

2.3 不同碳源對菌絲體生長的影響

不同碳源對多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖5所示。該菌株在5種供試碳源中均可生長，表明該菌株菌絲對單糖、雙糖及多糖均能利用，但菌絲長速和長勢存在差異。該菌株以葡萄糖作為碳源時菌絲生物量最大，達到466 mg/100 mL，且與其他碳源相比，差異顯著（P＜0.01）。因此，葡萄糖為菌絲生長的最佳碳源。

圖5 不同碳源對菌絲體生長的影響

2.4 不同氮源對菌絲體生長的影響

不同氮源對多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖6所示。結果表明，多形炭角菌菌絲體在6種供試氮源培養基中均能生長，但不同氮源對菌絲體生物量的影響有差異，其中以牛肉膏為氮源的菌絲體生物量最高，達到327 mg/100 mL。無機氮源中，除硫酸銨組外，供試氮源與空白對照菌絲體生物量差異均顯著（P＜0.05），但沒有達到極顯著水平（P＜0.01）。

圖6 不同氮源對菌絲體生長的影響

2.5 不同無機鹽對菌絲體生長的影響

不同無機鹽對多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖7所示。結果表明，其中以KH2PO4和MgSO4為無機鹽的菌絲體生物量較大，分別達到351 mg/100 mL和346 mg/100 mL，而以硫酸鋅為無機鹽的菌絲體生物量最少，只有32 mg/100 mL。

2.6 不同pH對菌絲體生長的影響

不同pH對多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖8所示。結果表明，多形炭角菌菌絲體在供試pH為4～9的培養基都能生長。培養基在pH 7時菌絲體生物量最高，達到386 mg/100 mL，pH 3時菌絲體生物量最低，為169 mg/100 mL。培養基pH偏酸或偏堿時，都不適宜菌絲體生長。因此可將pH 7選為多形炭角菌菌絲體液體發酵培養的最適pH。

圖7 不同無機鹽對菌絲體生長的影響

圖8 不同pH對菌絲體生長的影響

2.7 不同溫度對菌絲體生長的影響

不同溫度對多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖9所示。培養溫度15～25℃，隨著溫度的上升，菌絲生長速度加快，于25℃時菌絲體生物量最高，達到424 mg/100 mL，與其他溫度相比均達到極顯著水平（P＜0.01）。因此，最適培養溫度為25℃。

圖9 不同溫度對菌絲體生長的影響

3 小結與討論

天然藥用炭角菌資源非常稀少，子實體的人工栽培技術尚未成熟，利用現代生物技術進行液體深層發酵，可以得到大量的菌絲體和代謝產物[7]。探究多形炭角菌菌絲體液體發酵培養的最佳營養條件和最適環境條件，了解其生長特性，提高菌絲體產量，對炭角菌研究具有重要意義。多形炭角菌液體培養最佳碳源為葡萄糖，結果與欒洋等[8]的報道類似。炭角菌不僅能通過滲透作用直接吸收單糖，而且能分泌淀粉酶等胞外酶，將淀粉等分解成葡萄糖后吸收[9]。菌絲體能有效利用有機氮，而幾乎不能利用無機氮源。分析原因可能是由于有機氮除提供氮源外，還提供一定的碳素營養和生長因子，從而促使營養平衡和物質轉化[10]。供試無機鹽中磷酸二氫鉀、硫酸鎂對菌絲體生長有一定的促進作用，K、Mg、P是多形炭角菌生長必需的大量元素。

野生菌株T-18屬于多形炭角菌（Xylaria polymorpha），菌絲生長的最適溫度為25℃，最適pH為7.0，最適碳、氮源分別為葡萄糖和牛肉膏，添加一定量的MgSO4和KH2PO4有利于菌絲體的生長。