適于作為食品生產原料的蛹蟲草栽培基質的優化

曲星怡 黃登禹 孫永健* 班立桐 曹青青

（1天津天獅學院食品工程學院，天津301700；2天津農學院農學與資源環境學院，天津300384）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草，是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目昆蟲蛹上形成的子座與蛹的復合體[1-3]。目前蛹蟲草的大規模工廠化生產中，多以大米作為主要的栽培基質[4，5]。研究發現，蛹蟲草的大米培養基中含有豐富的蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸等功效成分，以及未被完全利用的大米蛋白、淀粉、膳食纖維等營養成分，可以作為食品、醫藥、化工等工業生產的原料[6-9]。近年來，許多學者利用采收蛹蟲草子實體之后的大米培養基（長滿菌絲體）為原料，開發出保健黃酒、功能食醋、風味醬油、焙烤食品等，在提高產品附加值、減少農業廢棄物對環境污染的同時，滿足人們日益增長的保健需求[10-14]。但蛹蟲草栽培基質中除大米外，通常會輔以其他碳源、氮源、無機鹽等成分，加之生物富集作用[15-20]。因此，需對其配方進行優化，在保證子實體產量及品質的同時，降低化學污染物殘留。研究為提高蛹蟲草栽培基質作為原料進行食品開發時的安全性，為擴大其應用前景提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設備

蛹蟲草菌種為天津天獅學院生物工程專業實驗室提供。

蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、VB1等均為分析純，購自天津風船化學試劑科技有限公司；大米、黃豆、蠶蛹粉、玉米淀粉等為市場采購。

光照培養箱（GZX-150BS）、恒溫培養振蕩器（KYC-100B）：上海圣科儀器設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-78A）：上海巴玖實業有限公司生產；RZ-2D2G雙人桌面（水平）凈化工作臺：廣州瑞智凈化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 栽培種制備

稱取馬鈴薯300 g，去皮后切成小塊，加500 mL蒸餾水煮沸30 min，用四層紗布過濾取濾液。向濾液中加入 MgSO41.5 g，KH2PO43 g，VB110 mg，葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1000 mL，分裝后于121℃下滅菌20 min。

在超凈工作臺內，挑取綠豆粒大小的蛹蟲草菌原種，接種于上述液體培養基中。于搖床內進行避光振蕩培養，溫度為22℃，轉速為120 r/min，3 d后選出菌液澄清、菌球長勢一致且無畸形的栽培種繼續培養2 d。

1.2.2 培養基配方試驗

在前期相關研究的基礎上，采用基礎基質用量為15 g/瓶，料液比為1∶1.2，栽培種接種量為8 mL/瓶的方案進行培養基的配制與接種。為提升栽培基質作為食品原料進行開發時的利用價值，向常見的大米培養基中添加適量的黃豆或帶麩皮的小麥，配方見表1，進行基礎基質優選時，培養料中的營養液每升含 有蛋白胨 8 g，蔗糖 7 g，KH2PO41 g，VB10.01 g。為提升栽培基質的食用安全性，基礎基質選定后，再對營養液中的碳源、氮源及其他添加物進行優選，以期利用更安全的食品級的碳源、氮源、維生素來替代栽培中常用的蔗糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4等化學試劑，配方見表2，表3和表4。每個處理進行5個重復。

表1 基礎基質配方

表2 碳源的種類及配比

表3 氮源的種類及配比

表4 其他添加物種類及配比

1.2.3 正交試驗優化

在1.2.2的基礎上，利用正交試驗對基礎基質的配比、營養液中的碳源、氮源和VC這4個因素進行3水平的設計。其中，L9（34）的9組正交試驗中因素與水平的設計見表5。以蛹蟲草子實體產量為指標，優化栽培基質配方。

表5 正交試驗因素水平

1.2.4 栽培管理

接種好的培養基，于室溫17℃避光培養，空氣相對濕度保持在65%～75%，待培養基表面布滿菌絲后將溫度調整為24℃，直至菌絲深入瓶底，吃透培養基。然后進行晝夜溫差培養，日間給予600 lx的光照12 h，溫度為22℃，夜間避光12 h，溫度為16℃，空氣相對濕度保持在60%～70%，培養10 d后開始形成原基。隨后晝夜給予600 lx的光照，溫度固定在22℃，空氣相對濕度保持在85%～90%，適當擰松瓶蓋，提高空氣流通性，促進子實體生長。當子實體尖端稍有膨大時，即可采收。

2 結果與分析

2.1 基礎基質配方對蛹蟲草培育的影響

按照一定比例向基礎基質中添加黃豆比、添加小麥能夠明顯縮短蛹蟲草的栽培用時，最多相差4.2 d。且隨著黃豆添加比例的增加，栽培時間逐漸縮短，當添加比例達到20%時，栽培時間最短，平均耗時58.2 d。繼續提高黃豆添加比例，栽培時間不降反升。添加小麥的栽培基質，蛹蟲草栽培時間隨小麥添加量的增加也逐漸縮短，但不如添加黃豆明顯。添加小麥對蛹蟲草生物學效率的影響并不大，平均生物學效率最高為94.6%。而黃豆的添加對蛹蟲草生物學效率有一定影響，平均生物學效率最高為95.3%。添加黃豆可豐富栽培基質的營養成分，增加植物蛋白含量，提高栽培基質作為食品原料進行開發時的利用價值。因此，向大米培養基中添加20%的黃豆為基礎基質的較優配方。

表6 采用不同配方基礎基質時蛹蟲草的栽培用時及生物學效率（n=5）

2.2 碳源對蛹蟲草產量的影響

3種碳源均可被蛹蟲草菌所利用，但碳源種類及添加量會對子實體的鮮重產生影響且存在差異。其中，以綿白糖（C2組）及玉米淀粉（C3組）為碳源的各處理，子實體鮮重均低于以蔗糖（C1組）為碳源的各處理，無論以何種比例添加，蛹蟲草菌更容易利用蔗糖。當營養液中的蔗糖與綿白糖添加量為9 g/L時，蛹蟲草子實體鮮重最大，分別為14.2 g/瓶與14.1 g/瓶，兩者相差并不大?？紤]到采收子實體后栽培基質將作為食品原料進行開發，因此確定綿白糖為較優碳源，營養液中的添加量為9 g/L。

表7 采用3種碳源以不同比例添加至栽培基質后蛹蟲草的產量（n=5）

2.3 氮源對蛹蟲草產量的影響

以奶粉為氮源的各處理（N31，N32，N33，N34），蛹蟲草子實體鮮重均低于以蛋白胨及蠶蛹粉為氮源的各處理。以蛋白胨為氮源時，該試驗組中的各處理（N11，N12，N13，N14）對蛹蟲草的產量影響不明顯。以蠶蛹粉為氮源時，隨著添加量的上升，子實體鮮重不斷增加，當營養液中添加量為35 g/L時，子實體鮮重最高為14.4 g/瓶。雖然添加蠶蛹粉相比于蛋白胨會增加蛹蟲草的培養成本，但可以提高子實體的產量與品質，且在利用采收子實體后的栽培基質作為原料開發食品時，可提升產品的食用安全性，豐富產品的營養成分。綜合考慮，確定蠶蛹粉為較優氮源，營養液中的添加量為35 g/L。

表8 采用3種氮源以不同比例添加至栽培基質后蛹蟲草的產量（n=5）

2.4 其他添加物對蛹蟲草生長的影響

單從蛹蟲草生長的各階段來看，S11處理的栽培基質，適于子實體的生長，所需時間最短，為32.4 d，S12處理的栽培基質，適于菌絲轉色及子座原基的形成，所需時間最短，分別為4.2 d與9.8 d。S13處理的栽培基質，適于菌絲體的生長，所需時間最短，為8.8 d。從蛹蟲草生長的整個過程來看，添加KH2PO4的栽培基質中（S11，S12），蛹蟲草的生長呈先慢后快，其中，S12處理添加了MgSO4，縮短了菌絲轉色、子座原基形成所需時間，栽培蛹蟲草耗時最短，為56.8 d。添加VC的栽培基質（S13）相比S11、S12處理，雖后期蛹蟲草生長趨緩，但整體栽培耗時仍低于S11處理，為57.2 d，僅高于S12處理0.4 d。綜合考慮向營養液中添加0.1 g/L的VC為較優的處理。

表9 含有不同添加物的栽培基質中蛹蟲草各生長階段所需時間（n=5）

2.5 栽培基質的優化

以每瓶中子實體鮮重為指標，對基礎基質的配比、營養液中的碳源、氮源和VC的添加量進行正交試驗優化。結果表明（表9），影響蛹蟲草子實體鮮重的主次因素排序為，蠶蛹粉＞黃豆＞VC＞綿白糖。考察這幾個因素在3個水平上的變化，確定較優方案為C3A2D2B3，即基礎基質的組成及配比為大米80%+黃豆20%，營養液中蠶蛹粉、VC、綿白糖的添加量分別為40 g/L、0.1 g/L、12 g/L。

表10 正交試驗直觀分析表

在對正交試驗結果進行方差分析時，選取綿白糖B作為誤差項，在α=0.05的條件下進行F檢驗，方差分析結果表明（表10），蠶蛹粉、黃豆、VC對蛹蟲草子實體的鮮重具有顯著性影響，三者變化對蛹蟲草的產量影響較大。

以較優方案培養蛹蟲草，驗證其可靠性，結果表明（表11），子實體鮮重比9組正交試驗設計當中的最大值還高，最高達到15.1 g/瓶，相對標準偏差（RSD）為2.05%，進一步驗證了正交試驗得出的較優方案。

表11 正交試驗方差分析

表12 驗證試驗結果

3 小結與討論

試驗結果表明，在目前應用比較成熟的蛹蟲草大米栽培基質中適當添加黃豆和帶麩皮的小麥，可以在不影響蛹蟲草子實體產量的前提下，縮短栽培時間，且提升栽培基質本身作為食品生產原料的營養價值。同時，黃豆可以提高蛹蟲草的生物學效率，從而提高對栽培基質的利用率，這可能是由于黃豆中富含的蛋白質，改善了栽培基質中的碳氮比，使其更適于蛹蟲草的生長；以綿白糖作為碳源，以蠶蛹粉作為氮源添加于營養液中，相比于常規蔗糖、蛋白胨來說，可以在不影響蛹蟲草產量、保證品質的前提下，提高了后續利用栽培基質作為食品原料開發利用安全性；VC的加入使得初始pH更適于蛹蟲草的生長，但對栽培基質的緩沖作用不如KH2PO4好，因此蛹蟲草的后期生長變慢，但整體效果仍優于KH2PO4。后續的研究可以尋找一種既可以為栽培基質提供較好緩沖作用，又能提供無機鹽營養作用的更安全的添加物。經正交試驗優化，最終確定適于作為食品生產原料的蛹蟲草栽培基質配方為，基礎基質為大米80%，黃豆20%，以1∶1.2的料液比添加營養液、碳源、氮源及其他添加物的較優配方為綿白糖12 g/L，蠶蛹粉40 g/L，VC 0.1 g/L，VB10.01 g/L。