新資源食品提取物輔助降血糖配方的確定

劉同方， 于燕波， 李淑娟， 沈起兵， 張國文， 李亦凡， 陳 斌

(深圳市綠航星際太空科技研究院， 廣東 深圳 518117)

隨著對糖尿病基礎研究的深入，越來越多的治療藥物研制成功并投入臨床使用。西藥降血糖作用明顯、起效快，但往往缺乏整體的協調性，具有明顯的副作用，不利于糖尿病患者長期使用[1]。近年來，諸多研究表明中藥對糖尿病具有多途徑、多靶點、多環節的綜合治療作用，且中藥治療疾病的毒副作用較小[2-4]。所以，從天然的植物中尋找降血糖的有效成分是開發治療糖尿病食品的一條重要的途徑。已有研究表明，白子菜[5]、苦瓜[6]、青錢柳[7]、桑葉[8]、甜茶葉[9]、玉竹[10]、葡萄皮[11]、枇杷葉[12]等植物中的活性成分具有降低血糖和促進胰島素分泌等作用。本研究主要通過對植物提取物進行篩選，并進行配方優化，最后進行體外降血糖功能評價實驗，以期為研制具有輔助降血糖功能的配方提供支持。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(MTT cell proliferation and cytotoxicity assay kit)，美國Amrecso公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，美國Sigma公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)，上海晶純生化科技股份有限公司；α-葡萄糖苷酶(酵母源)，美國Sigma公司；阿卡波糖片，拜耳醫藥保健有限公司；MEM低糖培養基及胰蛋白酶(含0.25%乙二胺四乙酸)，美國Gibco公司；地特胰島素，丹麥諾和諾德公司；HepG2細胞株購于北京協和醫院；葡萄糖測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、葡萄糖等均為分析純，購于國藥集團化學有限公司；提取物原料為固體粉末狀，由張家界至誠生物有限公司提供。

1.2 儀器與設備

DK-8B型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；BCL-1000A型超凈工作臺，北京亞太科隆公司；MCO-15AC型CO2培養箱，美國SANYO儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測定

取10 mL試管，依次加入pH=6.8磷酸緩沖液1.85 mL，0.40 U/mL酶溶液100 μL，加入100 μL樣品溶液，渦旋振蕩混合均勻，37 ℃恒溫水浴15 min，再加入0.011 6 mol/LpNPG溶液50 μL，渦旋振蕩混合均勻，37 ℃恒溫水浴20 min，再加入8.00 mL 0.20 mol/L Na2CO3溶液終止反應，405 nm處測定吸光度值，α-葡萄苷酶活性抑制率計算見式(1)。

(1)

式(1)中，E抑制率為α-葡萄苷酶活性抑制率，A空白為不加樣品反應后的吸光度值，A樣品為加入樣品反應后的吸光度，A背景為只加樣品的吸光度值，設阿卡波糖片為陽性對照組，每個樣品做3個平行，取平均值，計算抑制率。

1.3.2不同提取物原料體外酶抑制率活性比較

通過對不同濃度桑葉提取物、苦瓜提取物、葡萄皮提取物、甜茶葉提取物、白子菜提取物、玉竹提取物、青錢柳葉提取物和枇杷葉提取物等8種植物提取物原料(見表1)進行體外酶抑制率活性比較，篩選出活性較強的普通食品、新食品或藥食同源原料提取物進行配方優化設計。

表1 用于降血糖配方設計的8種植物提取物

1.3.3配方優化設計

通過不同原料活性比較實驗，選取活性高于陽性對照組的提取物原料，采用Design Expert 8.0.6中D-optimal限制成分上下界的方法，對組分用量范圍進行人為限制，然后通過對回歸方程及各組分等高線圖和響應曲面的分析，確定最優配方。

1.3.4HepG2細胞體外模型降血糖效果評價

1.3.4.1 胰島素抵抗HepG2細胞模型建立

參考文獻[13]方法建立體外細胞模型，HepG2細胞1×105個/mL接入細胞培養板，貼壁生長24 h后，加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h，再加入終濃度為1×10-7mmol/L的胰島素刺激10 min，即建立高濃度葡萄糖誘導的胰島素抵抗HepG2細胞模型。

1.3.4.2 細胞存活率的測定

采用MTT法測定細胞存活率[14]，當細胞生長至可傳代后用胰蛋白酶溶液消化，用MEM低糖培養基調整細胞密度為1×105個/mL，接入96孔板，每孔180 μL。貼壁生長24 h后向細胞中加入20 μL待測樣品，同時設添加20 μL 磷酸鹽緩沖液的細胞孔作為空白對照組，做6個平行實驗。孵育24 h后添加20 μL 5 mg/mL MTT，繼續培養4 h，隨后吸盡培養基并添加150 μL DMSO，室溫放置10 min后于570 nm處測定吸光度值。將空白組細胞存活率設置為100%，細胞存活率計算見式(2)。

(2)

式(2)中，γ細胞存活率為細胞存活率，A實驗組為添加待測樣品處理后測得吸光度值，A空白組為添加磷酸鹽緩沖液處理后測得吸光度值。

1.3.4.3 葡萄糖利用率的測定

根據葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法[15]測定葡萄糖含量，實驗組細胞同時添加葡萄糖溶液和樣品溶液，模型對照組添加葡萄糖溶液和等體積磷酸鹽緩沖液，空白組僅添加等體積無菌磷酸鹽緩沖液，添加葡萄糖終濃度為30 mmol/L，繼續孵育24 h，添加胰島素(終濃度為1×10-7mmol/L)刺激細胞10 min，隨后立即吸取上層培養基，用葡萄糖測定試劑盒測定葡萄糖濃度，葡萄糖利用率計算見式(3)。

(3)

式(3)中，c1為原培養基中葡萄糖濃度，5.55 mmol/L，c2為葡萄糖添加終濃度，0或30 mmol/L，c3為上層培養基中葡萄糖濃度，mmol/L。

2 結果與分析

2.1 不同提取物對α-葡萄苷酶抑制活性比較結果分析

不同提取物原料對α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較結果見圖1。

圖1 不同提取物原料對α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較Fig.1 Comparison of inhibitory activities of different extracts on α-glucosidase

由圖1可知，在相同質量濃度條件下，桑葉提取物、葡萄皮提取物、青錢柳葉提取物和枇杷葉提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率均大于陽性對照組，因此選取以上4種提取物進行配方優化設計。

2.2 配方優化設計結果分析

2.2.1混料設計方案及結果

運用Design-Expert 8.0.6數據統計分析軟件，得到實驗方案，并按照實驗方案進行實驗，結果見表2。

根據實驗結果建立回歸方程：

E抑制率=41.11A+44.25B+42.13C+35.58D-
26.63AB+17.66AC+33.36AD+17.97BC+
4.27BD+8.92CD-68.89ABC+176.71ABD-
63.09ACD+24.21BCD。

其中A、B、C、D分別表示枇杷葉提取物、青錢柳葉提取物、葡萄皮提取物、桑葉提取物的質量分數，由回歸方程和方差分析可見，擬合的三次方程中ABD和BCD三次項的系數為正值，說明枇杷葉提取物、青錢柳提取物、葡萄皮提取物和桑葉提取物對體外抑制率起到貢獻作用，二次項回歸系數AD項絕對值最大，說明在混料配方中枇杷葉提取物和桑葉提取物復配液對α-葡萄糖苷酶的體外抑制率的貢獻最大。

表2 混料設計方案及結果

2.2.2較佳復配比例的確定與驗證

當葡萄皮提取物添加比例固定在10.00%時，不同比例枇杷葉提取物、青錢柳提取物和桑葉提取物溶液對α-葡萄糖苷酶抑制率影響的等高線圖及3D響應面圖見圖2。其中響應面圖為曲面，表明因素之間存在交互作用。通過軟件優化功能，對最優配方進行優化，并對最優配方條件下的結果進行預測，結果見圖3。

通過數據分析，確定較佳復配比例為：枇杷葉提取物41.82%，青錢柳提取物26.05%，葡萄皮提取物10.00%，桑葉提取物22.13%，體外抑制率的預測值為 48.73%。按照最優的復配比例進行3次重復驗證實驗，計算結果，得到配方溶液對α-葡萄糖苷酶的體外抑制率為49.32%±0.15%，與響應面的預測值無明顯差異，說明響應面模型優化復配4種提取物的最佳復配比例的結果可靠。

2.3 HepG2細胞體外模型降血糖效果分析

2.3.1配方對HepG2細胞存活率的影響

圖2 不同比例提取物溶液對α-葡萄糖苷酶抑制率影響Fig.2 Effects of different proportions of extract solutions on inhibitory rate of α-glucosidase

圖3 數據處理軟件對較優配方比例的預測Fig.3 Prediction of proportion of better formular by data processing software

采用MTT法測定了配方樣品對HepG2細胞存活率的影響，數據采用Duncan’s multiple range test方法分析，不同字母表示顯著性差異，結果見圖4。結果表明，配方樣品在質量濃度0.125～0.500 mg/mL范圍內對細胞存活率均沒有顯著影響，說明配方樣品在質量濃度0.500 mg/mL及以下時對HepG2細胞沒有細胞毒性。因此，選定此濃度范圍進行后續實驗。

字母代表差異性。圖4 不同濃度配方樣品對HepG2細胞存活率的影響Fig.4 Effects of different concentrations formula sample on cytoactive of HepG2 cells

2.3.2配方樣品對高糖誘導胰島素抵抗HepG2細胞內葡萄糖利用率的影響

當加入高濃度葡萄糖刺激后，與空白對照組相比模型組的葡萄糖利用率顯著降低，說明成功建立了胰島素抵抗模型。采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定配方樣品對高糖誘導胰島素抵抗HepG2細胞內葡萄糖利用率的影響，結果見圖5。而在添加高濃度葡萄糖刺激的同時，加入不同濃度配方樣品處理，其中實驗組1添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.125 mg/mL樣品溶液，實驗組2添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.250 mg/mL樣品溶液，實驗組3添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.500 mg/mL樣品溶液。結果表明實驗組顯著提高胰島素抵抗模型的葡萄糖利用率，且促進作用呈現一定的濃度依賴效應。當樣品終質量濃度為0.500 mg/mL時細胞對葡萄糖的利用率最高，與模型組相比提高了37.88%。結果表明配方樣品對高濃度葡萄糖刺激HepG2細胞造成的胰島素抵抗具有一定的改善作用。

不同字母代表差異顯著。圖5 配方樣品對高糖誘導胰島素抵抗HepG2細胞內葡萄糖利用率的影響Fig.5 Effects of formula samples on glucose utilization in HepG2 cells induced by elevated glucose

2.3.3配方對高糖和高脂聯合誘導胰島素抵抗HepG2細胞內葡萄糖利用率的影響

不同字母代表差異顯著。圖6 配方樣品對高糖和高脂聯合誘導胰島素抵抗HepG2細胞內葡萄糖利用率的影響Fig.6 Effects of formula samples on glucose utilization in HepG2 cells induced by elevated glucose and free fatty acids

測定配方樣品對高糖和高脂聯合誘導胰島素抵抗HepG2細胞內葡萄糖利用率的影響，結果見圖6。當加入高濃度葡萄糖與棕櫚酸刺激后，與空白對照組相比模型組的葡萄糖利用率顯著降低，說明成功建立了胰島素抵抗模型。在添加高濃度葡萄糖和棕櫚酸刺激的同時，加入不同濃度配方樣品處理，其中實驗組1添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.125 mg/mL樣品溶液，實驗組2添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.250 mg/mL樣品溶液，實驗組3添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.500 mg/mL樣品溶液。結果顯示實驗組顯著提高胰島素抵抗肝細胞對葡萄糖的利用率。當配方樣本終質量濃度為0.500 mg/mL時細胞對葡萄糖的利用率最高，與模型組相比提高了25.63%。結果表明配方樣品對高濃度葡萄糖與棕櫚酸聯合刺激HepG2細胞造成的胰島素抵抗具有一定的改善作用。

3 結 論

本文通過對8種不同植物提取物原料進行體外酶抑制率比較，篩選出4種活性較強的提取物原料進行配方優化設計，對數據進行分析，得出4種提取物具有交互作用，較佳復配比例為：枇杷葉提取物41.82%，青錢柳提取物26.05%，葡萄皮提取物10.00%，桑葉提取物22.13%。HepG2細胞體外模型降血糖效果評價實驗結果顯示配方樣品可提高高糖誘導以及高糖-高脂聯合誘導胰島素抵抗HepG2細胞內葡萄糖利用率，降低細胞外的葡萄糖濃度，改善胰島素抵抗模型癥狀。

目前，本配方只進行了體外細胞模型評價降血糖效果實驗，輔助降血糖功能評價實驗有待完善，可望在此配方基礎上，結合感官評價開發一款輔助降血糖功能性食品。