海藻肥中海藻酸鈉的提取及分子量檢測

袁蕊，王學江，李峰

(五洲豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 煙臺 264000)

海藻肥是以天然海藻為原料，通過物理和生化工藝提取、精制或再混配以氮磷鉀和微量元素制成的生物肥，含有海藻特有的海藻酸鈉、海藻多糖、酚類聚合物、不飽和脂肪酸、植物自然生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等。海藻酸鈉又稱褐藻酸鈉或海藻膠，是從海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻細胞壁中提取的多糖化合物，主要由α-L-甘露糖醛酸(M單元)和β-D-古羅糖醛酸(G單元)2種單體聚合而成的線性高分子多糖，分子式為(C6H7O6Na)n，結(jié)構單元分子量理論值為198.11[1-3]。大量研究表明，海藻酸鈉可以降低水的表面張力，使作物有效吸收海藻肥中的有效成分，增加土壤團粒結(jié)構，破除板結(jié)。海藻酸鈉常被用于評價海藻肥質(zhì)量，行業(yè)內(nèi)出臺的海藻酸包膜尿素、海藻酸復合肥料、海藻酸水溶肥料標準都對該指標含量做了明確要求，但并未對分子量作規(guī)定，目前對海藻酸鈉分子量的檢測尚無統(tǒng)一方法，因此，對檢測方法的探討具有重要的現(xiàn)實意義。

海藻酸鈉的分子量是決定其流變性能、成膜性能、溶解性能等[4-5]性能的重要因素，常用測定海藻酸鈉分子量的方法是烏氏粘度法，通過測量其特性粘度值計算出其粘均分子量，此法的缺點是不能直接求出絕對平均分子量，而是通過經(jīng)驗公式計算，因此精確度較差[6-8]。高效液相色譜(HPLC)法是檢測高聚物分子量的常用方法之一，具有快速、高分辨率和重現(xiàn)性好的優(yōu)點[9-13]。本研究采用HPLC法對海藻酸鈉分子量測定方法進行研究，并測定海藻肥中海藻酸鈉分子量大小，為海藻酸鈉分子量的測定提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

T5、T10、T40、T70、T150、T500、T1000系列葡聚糖標準品，上海源葉生物科技有限公司；生物海藻液肥，五洲豐農(nóng)業(yè)科技有限公司；DEAE-52離子交換柱、G200凝膠層析柱，美國sigma-aldrih公司；無水乙醇、碳酸鈉、氯化鈣、苯酚、硫酸等試劑均為分析純。

高效液相色譜儀，美國珀金埃爾默公司；離心機、層析柱、紫外可見分光光度計，日本島津公司；自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠；恒流泵，上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 海藻酸鈉純化

將生物海藻液調(diào)pH值7左右，加入一定量10%氯化鈣溶液，析出海藻酸鈣凝膠，用碳酸鈉溶液溶解凝膠，充分攪勻，中和至pH值7～8，使凝膠脫鈣轉(zhuǎn)變成海藻酸鈉，離心除雜收集上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液，靜置過夜后12 000 r·min-1離心30 min，得到上清液和沉淀，沉淀中加入10%氯化鈉溶液，以離解沉淀復合物，離心后將上清液裝入截留分子量為3 000的透析袋中，磁力攪拌下用超純水透析24 h，每4 h換1次水，最后加入無水乙醇析出海藻酸鈉，多次洗滌并干燥，即得粗品海藻酸鈉[14-17]。

1.2.2 海藻酸鈉紫外光譜分析

配制一定濃度的海藻酸鈉粗品溶液，選擇波段190～400 nm，在紫外可見分光光度計中進行掃描。

1.2.3 海藻酸鈉的精純

將海藻酸鈉配成溶液，上DEAE-52離子交換柱(26 mm×200 mm)，然后用0.1 mol·L-1氯化鈉溶液進行洗脫，流速調(diào)節(jié)為1.0 mL·min-1，收集洗脫餾分，每管10 mL，收集液用苯酚-硫酸顯色法跟蹤檢測多糖，在波長為490 nm處測定吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內(nèi)的洗脫液合并，透析除鹽后濃縮備用。

1.2.4 海藻酸鈉純度鑒定

經(jīng)纖維素處理的海藻酸鈉溶液上葡聚糖G200凝膠層析柱(20 mm×300 mm)，去離子水洗脫，流速為1.0 mL·min-1，每5 mL收集1管，苯酚-硫酸顯色法測定490 nm處吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內(nèi)的洗脫液合并，蒸發(fā)濃縮后干燥。

1.2.5 HPLC檢測

色譜柱為PSS suprema linear M色譜柱，色譜柱檢測器為示差檢測器，流動相為超純水，流速0.5 mL·min-1，柱溫45 ℃，進樣體積20 μL[18-20]。將葡聚糖標準品配制成終濃度為1 g·L-1溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，以峰位保留時間(t)為橫坐標，相對分子量的對數(shù)值(lgMw)為縱坐標做標準曲線，得回歸方程。海藻酸鈉樣品配制成1 g·L-1溶液，進行HPLC分析，記錄峰位保留時間。根據(jù)待測樣品出峰時間及標準曲線，計算樣品分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉的分離純化

海藻酸鈉粗品溶液經(jīng)紫外光譜分析(圖1)，在260 nm和280 nm處無特征吸收峰，說明海藻酸鈉粗品不含核酸和蛋白質(zhì)。

圖1 海藻酸鈉的紫外光譜

海藻酸鈉粗品溶液經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱層析洗脫，G200凝膠層析柱分離并經(jīng)紫外光譜分析，呈現(xiàn)單一對稱峰，初步判斷其為單一組分。

圖2 海藻酸鈉葡聚糖凝膠柱洗脫的曲線

2.2 分子量標準曲線的繪制

葡聚糖系列標準樣色譜圖均只出現(xiàn)1個吸收峰，峰寬較窄且峰形較好。以葡聚糖標準品的分子量對數(shù)(lgMw)對保留時間(t)進行回歸處理，得線性回歸方程為：lgMw=-0.607t+13.07，R2=0.992，回歸關系較好。

2.3 海藻酸鈉分子量的測定

分離純化的海藻酸鈉經(jīng)HPLC檢測，有1個單一樣品峰，不含其他雜峰，峰型對稱，峰型較好，說明海藻酸鈉純化樣品為均一性組分，出峰時間為10.258 min，根據(jù)回歸方程計算得出，海藻液中褐藻酸鈉分子量在6 972 587附近分布。

3 討論

采用鈣析、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)絡合法，對海藻液進行初步純化，得海藻酸鈉粗品，粗品經(jīng)DEAE離子交換柱層析得到純化海藻酸鈉，經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜和高效凝膠液相色譜鑒定為單一組分，測得分子量在6 972 587附近分布。本研究采用的高效液相色譜法與粘度法相比，具有高效、快速、靈敏度高的優(yōu)點，所需樣品少，可用于低含量樣品檢測，避免烏氏粘度法通過經(jīng)驗公式計算所帶來的誤差。

目前市場上海藻肥種類繁多，有效物質(zhì)質(zhì)量評價也集中在海藻酸鈉的含量的測定。海藻酸鈉作為一種高分子聚合物，不同分子量具有不同生理活性。研究表明，海藻酸鈉的生理活性隨其分子量的變化而不同，分子大小對于其生物活性的發(fā)揮至關重要，2～10個單糖分子聚合而成的聚合物為褐藻寡糖，褐藻寡糖能夠促進植物生長發(fā)育，增強植物對外界環(huán)境的適應能力，具有提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)，提高多種酶的活性，清除自由基，遏制機體氧化等功能。周旭霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，酶解海藻酸鈉得到的褐藻膠寡糖具有較強的抗氧化活性，分子量越小的寡糖抗氧化性越強。張明杰等[22]發(fā)現(xiàn)，酶解制備的褐藻寡糖可有效清除DPPH和羥自由基，分子質(zhì)量最小的組分其清除羥自由基的能力與VC相近。胡博旸等[23]采用酸解海藻酸鈉得到不同分子量的海藻酸鈉組分，制備的褐藻寡糖具有較強的抗氧化能力，且抗氧化效果與寡糖的平均聚合度含量有關。李佳琪等[24]應用4種不同分子量的褐藻寡糖噴施在黃瓜幼苗葉片，經(jīng)寡糖處理過的幼苗株高、莖粗、株幅和鮮重均有顯著增加，且不同分子量的褐藻寡糖對黃瓜生長的促進效果存在差異。由此可見，分子量大小與海藻酸鈉生理活性密切相關。本研究為海藻肥中褐藻酸鈉分子量測定建立了檢測方法，既可以進行分離，也可以進行定量分析，為小分子海藻酸鈉分子量的測定工作提供了實踐依據(jù)，對其結(jié)構解析、功能研究及構效關系的探索具有重要意義。

圖3 海藻酸鈉的色譜