茭白、葡萄、枇杷莖葉的產甲烷潛力

孫紅英，諶茂秋，徐彥勝，朱能敏*

(1.甘肅經緯環境工程技術有限公司，甘肅 蘭州 730000； 2.成都新朝陽作物科學有限公司，四川 成都 610000； 3.農業農村部沼氣科學研究所，四川 成都 610000)

隨著我國城市規模的立體化擴展，大中型城市周邊的農業生產逐漸由傳統的水稻、小麥等糧食作物種植轉變成以水果、蔬菜等為主的非糧作物種植，隨之產生的大量作物莖葉的處理、處置已經成為推進鄉村振興過程中亟待解決的環境問題。這些作物莖葉富含有機質，可用作農村戶用沼氣池發酵的原料以實現其穩定化和資源化。長期以來，眾多學者對小麥、水稻和玉米等主糧作物秸稈產甲烷的可行性及其潛能開展了廣泛的研究，但對于非糧作物，特別是果蔬莖葉等廢棄生物質產甲烷的可行性和潛能還鮮見研究報道[1-2]。鑒于此，本研究以典型非糧作物茭白莖葉、葡萄莖葉和枇杷莖葉作為底物進行厭氧產甲烷試驗，分析測定發酵過程中的產氣量、甲烷含量，及其木質纖維素含量和紅外光譜特征等，以期為廢棄生物質的資源化利用和相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用廢棄生物質系采自農業種植區收獲果實后的茭白、葡萄、枇杷的莖葉。采集的莖葉經過自然晾干、粉碎、過篩等預處理后冷藏備用。厭氧發酵菌種取自以廢棄蔬菜葉為底物的厭氧發酵罐。分析純及更高純度的化學試劑購自中國國藥集團，試驗用水由密理博(Millipore)純水儀(18.2 MΩ·cm-1)提供。

1.2 方法

各試驗組分別取1 g相應植物的莖葉、20 mL菌液[菌濃度(2～3)×108mL-1)]、50 μL微量元素溶液(2 mg·kg-1Co、2 mg·kg-1Ni、10 mg·kg-1Fe、10 mg·kg-1Mn和10 mg·kg-1Zn)和40 mL去離子水一并放入100 mL血清瓶中，調整碳氮比后通入高純氮氣將瓶中剩余空氣排走。在不添加作物莖葉、不調整碳氮比條件下取與試驗組相同的菌液、微量元素溶液和去離子水放入血清瓶中，排空剩余空氣作為空白組。密封后的血清瓶放入35 ℃恒溫培養箱中進行發酵產甲烷。每組試驗設置3個平行，每天定時測定產氣量并取樣分析，發酵結束后取固相物自然風干備用。

1.3 測定

排水集氣法測定產氣量，氣相色譜-氫火焰離子檢測法測定甲烷含量，氣相色譜-熱導檢測法測定有機酸含量。元素分析儀(vario MICRO select)分析元素組成，美國國家可再生能源實驗室木質纖維素測定法(NREL)分析木質纖維素含量。

2 結果與分析

2.1 莖葉基本理化指標

表1顯示，枇杷和茭白莖葉的總固體含量相近，大于葡萄莖葉；枇杷和葡萄莖葉的揮發性固體含量相近，小于茭白莖葉。三種植物莖葉的總氮含量相近。枇杷莖葉總碳含量最高、葡萄莖葉總碳含量最低。一般來說，適宜厭氧發酵的底物碳氮比為25～30[3]，從表1可以看出，茭白莖葉的碳氮比處于此范圍內，而枇杷和葡萄莖葉的碳氮比在此范圍之外。

表1 供試植物莖葉的基本理化性質

就厭氧微生物降解難易程度而言，生物質中半纖維素是最易被厭氧微生物代謝的組成部分，纖維素次之，木質素最難被降解[4]。如表2所示，茭白莖葉中半纖維素和纖維素含量最高。就此推測，茭白莖葉在供試材料中的可生物降解性最強。結合木質纖維素組成、碳氮比和揮發性固體含量可以預判，3種莖葉中茭白莖葉的產甲烷潛力最高。

表2 供試植物莖葉半纖維素、纖維素和 木質素構成

2.2 發酵過程中pH及有機酸變化

適宜的pH是厭氧微生物進行正常生理代謝活動的必要條件。pH在6.5～7.5比較有利于厭氧微生物的生長代謝[5]。如圖1所示，3種植物莖葉在發酵過程中pH都處于堿性范圍(7.0～7.5)，且三者差異不顯著，發酵體系沒有出現嚴重酸化現象。

圖1 植物莖葉發酵過程中pH值變化

一般來說，發酵體系pH的變化與有機酸的產生、累積和消耗密切相關。由圖2～5可知，空白組中總有機酸累積濃度最低(<100 mg·L-1)，且以乙酸累積為主，枇杷和茭白組中以丙酸累積為主，最高濃度介于800～1 200 mg·L-1，所有發酵體系中丁酸的累積濃度都低于10 mg·L-1。這說明供試生物材料在生物質厭氧發酵產酸階段以產乙酸和丙酸為主。乙酸、丙酸濃度在發酵過程中都是先逐漸升高然后慢慢降低直到小于50 mg·L-1，表明隨著發酵的進行有機酸被慢慢降解轉化為甲烷。枇杷組中有機酸含量在70 d左右就穩定在20 mg·L-1左右，葡萄組中有機酸含量在110 d后才逐漸穩定，茭白組中有機酸含量在55 d左右就穩定在5 mg·L-1左右。結果說明，茭白葉中的有機碳最易被厭氧微生物降解利用，且降解速率最快。

圖2 空白組發酵過程中有機酸含量變化

圖3 枇杷組發酵過程中有機酸含量變化

圖4 葡萄組發酵過程中有機酸含量變化

圖5 茭白組發酵過程中有機酸含量變化

2.3 紅外光譜特征變化

傅立葉紅外光譜能反映有機物中官能團結構組成。如圖6所示，發酵前3種植物莖葉在850～900 cm-1都沒有檢測到任何的特征峰，但發酵后此波數范圍內卻出現了一個在空白組中也檢測到的單肩尖峰，推測該峰可能是菌種中有機質的特征峰，而非作物莖葉降解后形成的特征峰。發酵前枇杷莖葉和葡萄莖葉分別在1 700～1 750 cm-1、1 250～1 375 cm-1有一單肩弱峰，但這2個單肩峰在發酵后卻消失了。已有峰的消失和新峰的出現表明發酵過程中作物莖葉發生了分解，導致某些原有的有機官能團消失和新官能團形成。

圖6 厭氧發酵前后供試植物莖葉的紅外特征變化

沼氣產量能夠直接反映厭氧發酵過程和發酵效率。如圖7所示，空白組日產氣量在第一天達到8 mL，之后日產氣量幾乎都為0；葡萄莖葉日產沼氣量在前20 d較高，之后日產氣量降到5 mL以下，且零產氣量天數增多；枇杷莖葉日產氣量在前70 d波動較大，最高日產氣量達到25 mL；茭白莖葉日均產氣量在前40 d整體較高，最高達到了40 mL，日產氣量超過10 mL的時間也達到了20 d。從日產氣量有效持續時間可以判斷，供試植物中茭白莖葉產氣潛力最高。結合圖1中pH的變化，在整個發酵過程中3種植物莖葉發酵體系酸堿度適中，零日產氣量的出現可能與底物濃度低、微生物出現了貧營養的饑餓狀態有關。

圖7 供試植物發酵產沼氣動態

累計產氣量不僅能表明底物的產氣潛力，也能反映發酵過程中底物的降解效率。如圖7所示，空白組累計產氣量只有10 mL左右，說明在缺乏底物的條件下細菌只能利用自身細胞質作為碳源和氮源進行內源呼吸，產氣量有限。供試植物中，茭白莖葉累計產氣量最高(400.8 mL)，枇杷莖葉次之(250.8 mL)，葡萄莖葉最低(157.5 mL)，茭白莖葉的累計產氣量分別是葡萄莖葉和枇杷莖葉的2.5倍和1.6倍。此外，葡萄莖葉20 d累計產氣量接近總產氣量的90%，其產氣潛力幾乎完全釋放。枇杷莖葉發酵體系在40 d和70 d分別達到一個產氣量峰值，70 d之后累計產氣量趨于穩定。茭白莖葉的累計產氣量不僅在前40 d快速增加，即使是在40 d之后其累計產氣量也依然在緩慢增加。

甲烷是沼氣中唯一的可燃組分，其在沼氣中的體積分數不僅決定了沼氣的品質，而且直接反映了產甲烷菌的代謝活動。當發酵體系嚴重酸化時，沼氣中的二氧化碳體積分數顯著上升，而甲烷的體積分數明顯下降，且二氧化碳的體積分數高于甲烷[6]。如圖8所示，3種供試植物日產甲烷量的分布趨勢與日產沼氣量相似。茭白莖葉日產甲烷量在前40 d中超過5 mL的時間達到了15 d，最大值為每天20 mL，之后日產甲烷量依然保持在2～3 mL。枇杷莖葉日產甲烷量峰值出現在30～80 d，最高日產量為16.5 mL，但80 d后日產甲烷量下降，且日產量達到1.5 mL的天數不到10 d，其余時段內日產量幾乎為0。葡萄莖葉日產甲烷量只在10～20 d超過了5 mL且最大日產量為13 mL，其余時段內的日產量都不到2.5 mL，且零產甲烷天數較多。顯然，茭白莖葉的產甲烷潛力較枇杷莖葉和葡萄莖葉大，且產甲烷最快，說明茭白莖葉能較容易地被發酵過程中不同階段的微生物代謝利用，并最終轉化成為能源性氣體——甲烷。

圖8 供試植物發酵產甲烷動態

供試植物的累計產甲烷量變化趨勢與累計產沼氣量相似。茭白莖葉累計產甲烷量最高(182.3 mL)，枇杷莖葉次之(91.4 mL)，葡萄莖葉的累計產甲烷量最低(37.5 mL)，葡萄莖葉的累計產甲烷量只有茭白葉的1/5。茭白莖葉在前40 d的產甲烷速率在整個發酵周期內最高，明顯高于其他2種植物莖葉的產甲烷速率。在40 d后，茭白莖葉發酵體系的甲烷產量仍在緩慢增加，但枇杷莖葉和葡萄莖葉發酵體系的累計甲烷產量在最高產氣速率之后就幾乎穩定不變了。這表明，茭白莖葉中最易降解的成分被微生物快速利用后，剩下的有機組分仍能夠緩慢地被微生物代謝降解，但枇杷莖葉和葡萄莖葉中的剩余有機組分卻難以被微生物進一步利用。就累計產甲烷量達到穩定的時間而言，葡萄莖葉達到穩定的時間是茭白莖葉的1/2，而枇杷莖葉有2個亞穩定時間(分別是40和70 d)。結合累計甲烷產量變化趨勢，葡萄莖葉較短的穩定時間表明葡萄莖葉中易降解成分含量低，有效發酵時間短，產氣量(沼氣和甲烷)低。枇杷莖葉有2段穩定時間，說明枇杷莖葉中易代謝降解成分含量也較低，但難降解成分含量并沒有葡萄莖葉高，故而在最易降解的有機組分被利用之后，剩下的有機組分還能夠在微生物協同作用下被緩慢代謝利用并出現第2個產氣穩定期。

如表3所示，3種植物莖葉的半纖維素含量下降幅度都超過了70%，纖維素含量下降幅度只有茭白莖葉達到了28.34%，木質素含量反而上升。這表明半纖維素對產甲烷的貢獻率基本能達到70%以上，而纖維素的貢獻率只有茭白莖葉達到了30%左右，木質素對3種植物莖葉的產甲烷貢獻率均為0。發酵后3種供試植物中半纖維素含量均大幅下降，而木質素含量不降反升。這說明半纖維素是厭氧微生物最易利用降解的組分，而木質素較難被微生物代謝降解[7]。枇杷莖葉和葡萄莖葉半纖維素含量下降幅度較茭白莖葉小，原因可能是葡萄莖葉和枇杷莖葉中黃酮類和多酚類物質在水解產酸階段被釋放進入液相產物，對厭氧微生物，特別是產甲烷菌的生理代謝產生了一定的抑制作用[7-8]，從而導致葡萄莖葉和枇杷莖葉發酵體系產氣量較小。

表3 供試植物莖葉發酵后木質纖維素 相對含量降幅

3 討論

與乙酸相比，丙酸是較難被產甲烷菌代謝利用的有機酸之一，故而丙酸較乙酸更容易在發酵體系中累積[9]。然而在本研究中，葡萄莖葉發酵體系中卻以乙酸累積為主，說明葡萄葉發酵過程中的丙酸產量可能一直較低，葡萄莖葉組成不利于丙酸的產生。不同莖葉體系中，有機酸濃度開始下降以及最終達到平衡穩定的時間并不一致，間接說明了不同植物莖葉發酵速率的差異。結合供試3種植物莖葉的木質纖維素構成可以推測，發酵前期茭白莖葉快速產氣主要是微生物代謝利用半纖維素導致的，當半纖維素被降解利用之后，水解產酸菌在協同配合下進一步水解纖維素，生成產甲烷菌可利用的底物。枇杷莖葉和葡萄莖葉的半纖維素含量小于茭白莖葉，這導致前期枇杷莖葉和葡萄莖葉的產甲烷速率都小于茭白莖葉。另外，葡萄莖葉纖維素含量最低但木質素含量卻最高，在最易降解的半纖維素被利用完之后，水解產酸菌難以代謝剩下的大量木質素，導致其產氣周期最短。枇杷莖葉的半纖維素和纖維素含量都高于葡萄莖葉，但木質素含量卻低于葡萄莖葉；因此，當枇杷莖葉的半纖維素被快速利用之后，其中的部分纖維素被水解產酸菌水解生成能被產甲烷菌利用的底物，并在第一個產氣穩定期后出現了第二個產氣峰值和穩定期。

總體來看，本研究中生物質厭氧產生的沼氣和甲烷量與底物中的半纖維素含量正相關，半纖維素對底物產氣的貢獻率達70%以上，即半纖維素在底物產氣潛力預測中的權重可達70%；因此，通過分析測定底物中的半纖維素含量就能夠基本預測該底物的產氣潛力。纖維素對底物產氣的貢獻率與生物質材料種類密切相關，但其產氣貢獻權重小于半纖維素。木質素對有機底物產氣的貢獻權重幾乎為0。