蟬花多糖提取工藝的優(yōu)化

黃小忠，高大響，張雪松，宋剛，曾凡樂

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

蟬花(Cordycepscicadae)俗稱大蟬草，是一種被麥角菌科真菌感染寄生在幼蟬蟲體內(nèi)形成的一種菌蟲復(fù)合體。擬青霉菌通過感染蟬幼蟲后[1]，寄生在蟲體內(nèi)，將蟲體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化成菌絲體，待到環(huán)境條件適合時(shí)，菌絲分化，從蟬的頭部形成子實(shí)體，且在子實(shí)體的頂端會(huì)長(zhǎng)出具有繁殖功能的孢子。蟬花是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌之一，與冬蟲夏草有著相似的功效[2]。經(jīng)醫(yī)學(xué)研究證明，蟬花具有降血糖及增強(qiáng)免疫力、降血壓、抗腫瘤、改善腎功能等作用[3]。

蟬花包括三個(gè)結(jié)構(gòu)：菌殼、孢梗束、蟬花孢子。蟬花中的有效成分包括多球殼菌素、核苷類成分、麥角固醇及其過氧化物、環(huán)肽化合物、多糖、蟲草酸等，其中真菌多糖被廣泛應(yīng)用到醫(yī)療方面。多糖的提取方法有水提法、微波法、超聲波輔助法、苯酚硫酸法、酶解法等[4]，水提法因其操作簡(jiǎn)單、儀器設(shè)備要求不高、所需材料簡(jiǎn)單而應(yīng)用廣泛。本試驗(yàn)通過對(duì)幾種提取條件的考察，優(yōu)化多糖提取工藝，旨在為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蟬花菌種來(lái)自江蘇食用菌研究所。

1.2 方法

1.2.1 干燥蟬花菌體準(zhǔn)備

將新鮮蟬花子實(shí)體用蒸餾水浸泡0.5 h，用軟毛刷將菌體上殘土去除，再用蒸餾水清洗5次，確保菌體無(wú)多余雜質(zhì)。將瀝水后的蟬花菌體平放在鋪有干凈紙張瓷盤中，60 ℃烘箱中干燥至恒重[5]。

1.2.2 蟬花菌體的粉碎

干燥蟬花菌體經(jīng)粉碎機(jī)粉碎5 min，用40目(孔徑0.42 mm)篩子過篩，棄雜質(zhì)，再用60目(孔徑0.25 mm)篩子過篩。菌粉呈棕褐色，無(wú)雜質(zhì)[6]。

1.2.3 料液比單因素試驗(yàn)

取50 mL燒杯空杯稱重，然后加入2 g蟬花菌體粉，再分別加入25、20、15、10、5倍純水，用玻璃棒攪勻，用保鮮膜將燒杯封口并編號(hào)，于陰涼干燥的室溫下放置6 h，后放進(jìn)超聲細(xì)胞破碎儀，調(diào)整好高度，破碎儀的探頭應(yīng)在燒杯液體平面下1 cm。調(diào)整破碎儀的變幅桿選擇開關(guān)至Φ6，超聲5 s，間隔6 s，溫度60 ℃，時(shí)間30 min，取出燒杯。保鮮膜封口，60 ℃水浴1 h，將燒杯中的液體移至50 mL離心管，用10 mL純水洗凈殘?jiān)岭x心管，3 000 r·min-1離心5 min，膠頭滴管吸管吸取上清液。將收集好的上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃蒸發(fā)濃縮，收集濃縮液，加入4倍濃縮液體積的95%乙醇，保鮮膜封口后于4 ℃冰箱過夜。待多糖沉淀析出后，敞口將燒杯放進(jìn)60 ℃的水浴鍋內(nèi)揮發(fā)酒精，等燒杯中無(wú)明顯液體后，把燒杯放進(jìn)60 ℃烘箱干燥4 h，以上每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

1.2.4 預(yù)浸泡時(shí)間單因素試驗(yàn)

取50 mL燒杯空杯稱重，然后加入2 g蟬花菌體粉，再各加入20倍的純水并攪勻，用保鮮膜將燒杯封口并編號(hào)，在陰涼干燥的室溫下分別進(jìn)行3、4、5、6、7 h的預(yù)浸泡處理，其余操作同上，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

1.2.5 超聲時(shí)間單因素試驗(yàn)

取50 mL燒杯空杯稱重，然后加入2 g蟬花菌體粉，再各加入20倍的純水?dāng)噭颍帽ｕr膜將燒杯封口并編號(hào)，陰涼干燥的室溫下放置6 h。將燒杯放進(jìn)超聲細(xì)胞破碎儀，調(diào)整好高度，破碎儀的探頭應(yīng)在燒杯的液體平面下1 cm。調(diào)整破碎儀的變幅桿選擇開關(guān)至Φ6，60 ℃的條件下分別處理10、20、30、40、50 min。其余操作同上，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取適量的葡萄糖，加入純水定容配制成0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7只試管，用吸量管準(zhǔn)確吸取分別加入1.1、0.9、0.7、0.5、0.3、0.1、0 mL上述溶液，定容至2.0 mL，加入1.0 mL 6%苯酚溶液混勻，加5.0 mL濃硫酸，混勻靜置冷卻至室溫，沸水浴15 min，冷卻至室溫。分光光度計(jì)測(cè)定490 nm處的吸光值，縱坐標(biāo)是測(cè)定的吸光值，橫坐標(biāo)是葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，得到回歸方程y=0.194x+0.013 7，R2=0.990 3。

1.2.7 蟬花多糖提取

精密稱取適量的蟬花多糖，加入純水定容配制成0.2 mg·mL-1的多糖溶液，用吸量管準(zhǔn)確吸取上述溶液0.5 mL加入到容量瓶中，加水定容至2.0 mL，測(cè)定條件參考標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法[7-8]。將所得的蟬花多糖吸光值代入上述的回歸方程，計(jì)算出多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算蟬花多糖提取率。

1.2.8 正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)可得水浴時(shí)間、預(yù)浸泡時(shí)間、料液比、超聲時(shí)間等單因素的最適范圍，因水提時(shí)間單因素與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后顯示影響不大，所以正交試驗(yàn)不再做水提時(shí)間的設(shè)計(jì)，選取水提1 h為標(biāo)準(zhǔn)操作時(shí)間。表1為設(shè)計(jì)的正交因素水平，選取預(yù)浸泡時(shí)間(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)3因素的最典型條件進(jìn)行正交試驗(yàn)。1～3水平A分別為5.5、6.0和6.5 h，B分別為15、20和25倍，C分別為35、40和45 min。

1.2.9 數(shù)據(jù)整理

菌粉稱取質(zhì)量、燒杯空杯重量、稱取的蟬花多糖質(zhì)量等精確至0.1/1 000，采用Excel 2010對(duì)蟬花多糖提取數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素

2.1.1 料液比

蟬花多糖的提取率受料液比影響明顯。從圖1可知，20倍的料液比的提取率最高，表示提取的蟬花多糖含量最高。

圖1 料液比倍數(shù)與提取率的關(guān)系

2.1.2 預(yù)浸泡時(shí)間

從圖2可知，提取率隨著預(yù)浸泡時(shí)間的增加而增大，到達(dá)一定時(shí)間后，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加浸泡時(shí)間，提取率隨之減小。6 h的預(yù)浸泡時(shí)間提取的蟬花多糖提取率最高。

圖2 預(yù)浸泡時(shí)間與提取率的關(guān)系

2.1.3 超聲時(shí)間

超聲時(shí)間對(duì)蟬花多糖的提取有明顯影響。從圖3可知，10和20 min超聲時(shí)間時(shí)的提取率較低，30 min超聲的提取率開始大幅增加，可見超聲時(shí)間對(duì)于蟬花多糖的提取率影響較大。結(jié)果表明，40 min超聲時(shí)提取率達(dá)到最大，隨后開始降低。

2.2 正交試驗(yàn)

將正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)按照單因素的步驟操作試驗(yàn)，得到的試驗(yàn)結(jié)果如表1。

由表1可知，對(duì)于蟬花多糖提取率來(lái)說，超聲時(shí)間對(duì)其影響最大，其次是料液比因素，最后是預(yù)浸泡時(shí)間。通過正交試驗(yàn)可得，最好的提取條件為45 min的超聲時(shí)間、20倍的料液比和6.5 h的預(yù)浸泡時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間與提取率的關(guān)系

組合號(hào)ABC提取率/%111115.2212218.3313327.6421220.2522325.2623117.8731328.1832125.3933220.2K161.263.558.3K268.268.858.7K373.665.681.0K120.421.219.4K221.122.919.6K324.521.927.0R4.11.87.6

2.3 各因子對(duì)蟬花多糖提取的影響

2.3.1 超聲時(shí)間

在45 min的超聲時(shí)間范圍內(nèi)，蟬花多糖提取率達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)槌曁幚頃?huì)使菌粉在溶液中產(chǎn)生空化破裂，提取劑進(jìn)入菌粉細(xì)胞組織內(nèi)部，使多糖可以更好的溶出。但隨著時(shí)間的推移，提取劑中的水溶性雜質(zhì)濃度越來(lái)越高，提取劑中的傳質(zhì)阻力越來(lái)越大，且破碎儀的工作效率很高，所具有的機(jī)械剪切能力很強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致多糖中的糖鏈斷裂，其多糖的藥理活性會(huì)受到影響。超聲時(shí)間太短不能充分裂解蟬花細(xì)胞，試驗(yàn)表明，45 min左右的超聲時(shí)間為最佳。

2.3.2 預(yù)浸泡時(shí)間

蟬花粗多糖的提取率在一定范圍內(nèi)會(huì)隨著預(yù)浸

泡時(shí)間的增加而增加，3 h的預(yù)浸泡時(shí)間的提取率較低，6 h預(yù)浸泡達(dá)到較大值，是前者的2倍之多，而6.5 h后提取率開始降低。隨著浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)，提取劑中多糖濃度增大，多糖的傳質(zhì)作用變緩。預(yù)浸泡時(shí)間太短，多糖不能充分溶解，因此，浸泡時(shí)間不宜過長(zhǎng)或過短，6.5 h左右最適宜。

2.3.3 料液比

隨著提取劑量的增大，蟬花粗多糖的提取率也隨著升高，達(dá)最大提取率時(shí)，料液比是1∶20，之后隨著料液比增加，提取率不再增加。如果提取劑比例太小，溶劑不能使菌粉充分浸透，提取率則降低，蟬花粗多糖不能完全被浸泡出來(lái)。而溶劑過多，會(huì)導(dǎo)致提取濃度過低。試驗(yàn)表明，20倍的料液比是最適比例。

3 小結(jié)與討論

通過正交試驗(yàn)表明，各因素對(duì)蟬花多糖提取率的影響程度為超聲時(shí)間>預(yù)浸泡時(shí)間>料液比，最優(yōu)提取條件為45 min超聲時(shí)間、20倍料液比、6.5 h預(yù)浸泡時(shí)間，提取率達(dá)27.0%。優(yōu)化多糖提取工藝，打破傳統(tǒng)提取方法，探索更好的提取條件，使提取工藝更加方便、快捷、環(huán)保，從而提升蟬花開發(fā)的價(jià)值，該研究為蟬花多糖提取開發(fā)提供參考。