石韋內生真菌SW-7產黃色素的發酵條件

裴梟鑫，吳迪，李玉芳，袁彥彥，劉俊林*

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730110； 2.西北民族大學 化工學院，甘肅 蘭州 730110)

隨著人們對食品安全的注重和對健康意識的提高，天然色素越來越受人們的關注和喜愛，其中黃色素約占市場需求量的60%以上。目前，市場上常見的黃色素產品多以植物提取為主(如姜黃素、南瓜黃、梔子黃等)，但易受季節、氣候、產地等許多因素的影響[1]。微生物作為正在開發的新興資源它將擁有很大的研究空間，目前已發現多種菌可產黃色素，如趙靖等[2]發現，紅曲霉具有產紅曲黃色素的能力。楊柳等[3]發現，粒毛盤菌可產黃色素并研究了其色素的穩定性。左勇等[4]在研究P.agaridevorans紅色素時發現，該菌具有產黃色素的能力。今從藥用植物石韋葉中分離純化得到產黃色素真菌，可作為黃色素的新型來源。

真菌廣泛存在于自然界，在長期進化中，一些真菌尋找到理想的生活環境——植物體，進入植物體并和諧地與之生活在一起，成為植物體微生態系統的組成部分。它們生活在植物的根、莖、葉等器官的組織內部，但一般不引發植物體病害，這些真菌被稱之為內生真菌[5]，內生真菌因其生于植物體內部，故不同于別種真菌，其賦予產特殊產物的能力的幾率更大，因此備受關注[6]，目前研究已發現內生真菌具有產抑菌[7]、抗腫瘤[8]、防線蟲[9]、抗氧化[10]等功能產物的能力，更是很多天然產物的新來源。

石韋又名石皮、金星草、石蘭，味甘苦，性微寒，歸肺、膀胱經，能利尿通淋、清肺止咳、涼血止血，用于熱淋、血淋、石淋、小便不利、淋瀝澀痛、肺熱咳嗽、吐血、衄血、尿血、崩漏等癥狀。石韋中主要含有里白烯、β-谷甾醇、綠原酸、杧果苷、槲皮素、異杧果苷、異槲皮素、蔗糖等多種成分[11]。該真菌是從石韋干葉中分離得到的1株菌，在其生長過程中產生大量的黃色素，且性質相對穩定。天然色素研究受到大家的重視，但對真菌產黃色素的研究少有報道。本試驗對產黃色素真菌(SW-7)生長條件進行初步分析，對該真菌深層發酵條件進行優化研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

從石韋內分離得到1株內生真菌。

1.1.2 供試培養基

PDA培養基。200 g土豆切小塊煮沸30 min，擠壓過濾，濾液中加20 g葡萄糖。

大米培養基。大米粉20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，NaNO32 g，KH2PO41.5 g，MgSO41 g。

查氏合成培養基。蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g。

高氏培養基。可溶淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g。

以上培養基均完全溶解后添加蒸餾水定容至1 000 mL。在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

將內生真菌(SW-7)接種至平板培養基，28 ℃培養4 d，用滅菌接種環輕刮菌體表面，釋放孢子。10 mL孢子液接種至100 mL種子液培養基中，30 ℃、160 r·min-1培養36 h。

1.2.2 黃色素發酵培養基選擇

向4種50 mL菌體培養基中分別接入5 mL種子液，在28 ℃、160 r·min-1暗培養發酵，顏色穩定后進行發酵物分離、色素吸光值(D)測定和生物量測定。

1.2.3 深層發酵試驗正交設計

在以上試驗基礎上選擇PDA液體培養基為發酵底物，以菌體生物量、黃色素為目的物，設轉速(A)、pH值(B)、溫度(C)和發酵時間(D)四因素進行正交試驗設計。

1～4水平：A分別為140、150、160、170 r·min-1；B分別為5、6、7、8；C分別為26、28、30、32 ℃；D分別為6、8、10、12 d。

1.2.4 發酵產生菌體生物量的測定

將達到發酵終點的發酵液5 000 r·min-1離心10 min后去上清液，沉淀用滅菌水洗滌2遍，在60 ℃烘箱中烘干至恒重，分析天平準確稱量得到菌絲體質量，即為發酵產生菌體的生物量[12]。

1.2.5 黃色素發酵原液吸光度的測定

參照文獻[13]稍作修改，準確取一定體積發酵原液濾液將達到發酵終點的發酵液5 000 r·min-1離心10 min后取上層液，稀釋至一定倍數，并于375 nm所測得的最大吸收峰處測D值。

2 結果與分析

2.1 SW-7在不同培養基中生長狀況

如表1所示，SW-7在PDA培養基中菌絲體產量最多，色素產量也最大；SW-7在大米培養基中的生物量和色素量皆僅次于PDA；在查氏培養基中菌株長勢雖好，但不適用于黃色素的深層發酵；在高氏培養基中色澤偏黃綠色，影響了色素色澤，故在后期正交試驗中使用PDA培養基為基礎進行SW-7的發酵條件研究。

表1 SW-7菌株在4種培養基中生長狀況

2.2 SW-7菌體在深層發酵的表現

由表2可知，培養溫度(F值=15.426*)和發酵時間(F值=20.400*)對SW-7黃色素產量影響亦顯著。根據F值大小得出4個因素對SW-7菌體產量影響大小次序為發酵時間、溫度、初始pH值(F值=2.101)、轉速(F值=1.341)；根據K值得出以真菌菌體產量為目的物的最佳組合為A3B1C3D3，即轉速160 r·min-1、初始pH值5、溫度30 ℃、發酵時間10 d。在此條件下通過驗證實驗可得，搖瓶發酵菌體產量為7.68 g·L-1，色于此條件下發酵產色素。本試驗目的是提高色素產素吸光度為1.716，表明真菌SW-7最適量，故以A3B1C3D3方案為最終發酵最佳條件。

表2 SW-7深層發酵正交試驗直觀分析

3 小結

通過對比SW-7在不同培養基中生長狀況和產色素能力發現，SW-7較適合于PDA培養基和大米培養基；SW-7在天然培養基中生長較合成培養基更快更好，分泌產物能力更強，在PDA培養基上分泌色素色澤偏深黃，而在大米培養基則為金黃色。選擇PDA培養基來深層發酵石韋內生真菌SW-7黃色素，通過正交試驗設計的方式綜合分析影響本菌分泌色素的因素，從而達到優化該菌發酵產黃色素的發酵方案，得出適合于SW-7產生黃色素物質的基本條件為轉速160 r·min-1、pH值5、發酵溫度30 ℃、發酵時間10 d。經過二次試驗驗證，在該條件下，真菌菌體為7.68 g·L-1，色素吸光度為1.716。通過本試驗的條件優化，SW-7色素產量明顯增大，為SW-7真菌色素的利用提供理論依據。