西瓜炭疽病菌離體葉片接種鑒定技術(shù)

孫玉燕，范敏，何艷軍

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

西瓜(Citrulluslanatus)隸屬葫蘆科西瓜屬植物，我國目前西瓜的年栽培面積約為187萬hm2，總產(chǎn)量約為7 900萬t，居世界首位，其中浙江省西瓜年栽培面積約為7萬hm2，總產(chǎn)量約為215萬t[1]。西瓜炭疽病(Colletotrichumlagenerium)是由瓜類炭疽病菌引起的一種世界性病害，在保護(hù)地及露地栽培中均可發(fā)病，特別是在濕度較大的南方地區(qū)發(fā)病尤重，造成西瓜大量減產(chǎn)，甚至絕收。西瓜炭疽病在全生育期均可發(fā)病，葉片染病后，初為圓形或不規(guī)則形水漬狀斑點(diǎn)，后變褐色，出現(xiàn)同心輪紋；莖蔓染病，初始出現(xiàn)水漬狀黃褐色圓形或長橢圓形凹陷病斑，后變黑褐色，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致莖蔓枯死；果實(shí)染病表現(xiàn)為水浸狀凹陷形褐色圓斑或長圓形斑，濕度大時(shí)病斑上產(chǎn)生粉紅色黏狀物[2-3]。目前防治西瓜炭疽病的主要方法包括選用抗病品種、對種子進(jìn)行溫湯浸種或藥劑拌種、輪作、加強(qiáng)田間管理、控溫濕度、藥劑防治等措施，其中選育具有炭疽病抗性的西瓜品種是解決西瓜炭疽病的根本途徑。

西瓜抗病性鑒定篩選評價(jià)工作是抗病育種的重要環(huán)節(jié)。目前，西瓜炭疽病的抗性鑒定及評價(jià)方法有以下2種。1)苗期噴霧接種及分級(jí)評價(jià)法。將炭疽病菌配成孢子濃度為1×106的懸液，噴霧法接種于二葉期的無菌苗上，置于24～26 ℃、相對濕度95%～100%的黑暗條件下保濕48 h后給予正常光照，7～10 d后觀察發(fā)病情況[4-5]。參考劉莉等[6]的方法將西瓜幼苗對炭疽病的抗性分為0、1、3、5、7、9等6個(gè)等級(jí)。2)離體葉接種和AD評價(jià)法。配置孢子濃度為1×106的菌液，利用注射器懸滴接種葉齡為15～20 d的離體葉片，接種后第6天調(diào)查發(fā)病情況。抗病鑒定利用平均病斑直徑和病情指數(shù)進(jìn)行評價(jià)[7]。此外，西瓜炭疽病的接種方法還包括涂抹法及點(diǎn)滴法[6]。

本研究利用點(diǎn)滴法對西瓜離體葉片進(jìn)行炭疽病接種鑒定，并利用病斑直徑及發(fā)病率對西瓜種質(zhì)材料進(jìn)行抗病性鑒定評價(jià)。與活體接種鑒定相比，離體葉片接種鑒定具有不損傷植株、節(jié)省菌液、接種標(biāo)準(zhǔn)一致、不產(chǎn)生病原菌擴(kuò)散等優(yōu)點(diǎn)，可為西瓜炭疽病的抗性鑒定及篩選評價(jià)提供新的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用病菌為長嶺西瓜炭疽病菌，由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所宋鳳鳴教授團(tuán)隊(duì)提供。接種材料為浙江省農(nóng)科院蔬菜所西瓜研究室提供的12份西瓜種質(zhì)材料，分別為Charleston Gray、Navajo Sweet、PI288317、PI279460、PI368509、PI536457、PI278038、Sun sweet、Ford hook、鄭州2號(hào)、冬瓜皮、慶久。將這些材料的種子在55 ℃溫水浸種后，在室溫下浸泡3～4 h，用濕潤毛巾包裹好，放入28 ℃恒溫箱中催芽36 h，待種子萌芽后播入育苗穴盤中，育苗基質(zhì)由草炭和蛭石按3∶1的比例配置而成。每份材料9株，待第4片真葉完全展開時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行接種。

1.2 炭疽病菌培養(yǎng)取樣及離體葉片處理

PDA液體培養(yǎng)基配置。200 g新鮮馬鈴薯去皮后切成小塊，煮沸30 min，2層紗布過濾去除殘余，在濾液中加入20 g葡萄糖，蒸餾水定容至1 000 mL，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

炭疽病菌培養(yǎng)。將保存的長嶺西瓜炭疽病菌轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，將其在溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為200 rpm的搖床上避光搖3 d，使其產(chǎn)生大量的孢子，將含孢子的PDA液體培養(yǎng)基用2層無菌紗布過濾，除去菌絲以獲取孢子懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為1×106mL-1，用于接種鑒定。

離體葉片處理。利用剪刀剪取植株第4片完全展開的真葉，以75%酒精表面消毒后，用無菌水沖洗，用吸水紙吸干表面水分，切口用封口膜封好，備用。

1.3 炭疽病菌接種離體葉片

在透明塑料盒底層放入吸水紙，并加入無菌水使其濕潤，將準(zhǔn)備好的離體葉片置于吸水紙上。用微量移液器在葉片表面點(diǎn)滴10 μL長嶺西瓜炭疽病菌孢子懸浮液，每個(gè)葉片根據(jù)不同大小接種3～5個(gè)點(diǎn)(圖1)，并用透明塑料蓋子密封。將塑料盒放在25 ℃、濕度90%的培養(yǎng)箱中，暗處理48 h后給予正常光照，選擇無菌PDA接種為對照，每份種質(zhì)處理9個(gè)葉片，5 d后調(diào)查發(fā)病情況。

圖1 點(diǎn)滴法對西瓜離體葉片接種長嶺西瓜炭疽病菌

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

抗性鑒定指標(biāo)有平均病斑直徑及發(fā)病率。病害調(diào)查時(shí)，用電子游標(biāo)卡尺測量每個(gè)接種點(diǎn)病斑的最大長度和最大寬度，記作縱徑和橫徑。病斑直徑為所有接種點(diǎn)病斑橫徑和縱徑的平均值。根據(jù)病斑直徑[7]對材料的炭疽病抗性進(jìn)行劃分：0 mm，免疫；<0.50 mm，高抗；0.51～1.50 mm，抗病；1.51～2.00 mm，中抗；2.01～3.00 mm，感病；>3.01 mm，高感。

另外調(diào)查葉片發(fā)病率，即發(fā)病點(diǎn)占總接種點(diǎn)的百分比。用SAS和Excel軟件對抗性鑒定的指標(biāo)即平均病斑直徑和發(fā)病率數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長嶺西瓜炭疽病菌觀察及發(fā)病癥狀表現(xiàn)

將長嶺西瓜炭疽病菌接種到PDA固體培養(yǎng)基中，生長至第10天，菌落顏色由中心至邊緣變?yōu)樯罨疑吘壊睿霈F(xiàn)同心輪紋。顯微鏡下顯示分生孢子為無色，單孢為卵圓或長圓形，具有隔膜。西瓜葉片接種長嶺西瓜炭疽病菌后，出現(xiàn)長橢圓形或不規(guī)則形的褐色同心輪紋(圖2)。

圖2 長嶺西瓜炭疽病菌的菌落表型、孢子形態(tài)及發(fā)病癥狀

2.2 西瓜種質(zhì)抗病性鑒定

采用點(diǎn)滴法對西瓜離體葉片進(jìn)行炭疽病菌接種，5 d后調(diào)查發(fā)病結(jié)果。
圖3顯示，不同種質(zhì)材料對長嶺西瓜炭疽病菌的抗性表現(xiàn)不同，有的種質(zhì)材料對長嶺西瓜炭疽病菌表現(xiàn)為免疫，而有的材料在長嶺西瓜炭疽病菌侵染后整個(gè)葉片出現(xiàn)病斑。

圖3 點(diǎn)滴法篩選獲得不同抗性的西瓜種質(zhì)材料

利用平均病斑直徑及發(fā)病率[7]對12份西瓜種質(zhì)的炭疽病抗性進(jìn)行評價(jià)(表1)。這12份西瓜種質(zhì)材料的平均病斑直徑為0～13.79 mm，發(fā)病率為0～88.00%，抗性存在較大差異。其中獲得對長嶺西瓜炭疽病菌免疫的材料1份(PI368509)，病斑直徑為0 mm，發(fā)病率為0；抗病材料1份(PI278038)，病斑直徑為0.71 mm，發(fā)病率為17.50%；中抗材料1份(Sun sweet)，病斑直徑為1.94 mm，發(fā)病率為25.00%。此外，對長嶺西瓜炭疽病菌表現(xiàn)為感病的材料1份(鄭州2號(hào))，病斑直徑為2.07 mm，發(fā)病率為18.18%；對長嶺西瓜炭疽病菌表現(xiàn)為高感的種質(zhì)材料為8份，包括Charleston Gray、Navajo Sweet、PI288317、PI279460、PI536457、Ford hook、冬瓜皮、慶久，病斑面積為3.88～13.79 mm，發(fā)病率為30.33%～88.00%。

表1 離體葉片接種長嶺西瓜炭疽病抗性鑒定結(jié)果

此外，對平均病斑直徑及發(fā)病率的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，二者相關(guān)系數(shù)達(dá)0.88，說明平均病斑直徑與發(fā)病率為顯著正相關(guān)。上述結(jié)果表明，結(jié)合點(diǎn)滴法進(jìn)行離體葉片鑒定技術(shù)及利用平均病斑直徑和發(fā)病率的抗性評價(jià)體系，可以篩選出抗性不同的種質(zhì)材料，為西瓜炭疽病的抗性遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與討論

浙江省處于亞熱帶地區(qū)，常年高溫、多雨、濕度較大，極易導(dǎo)致西瓜炭疽病的暴發(fā)與流行。目前生產(chǎn)上防治西瓜炭疽病主要依賴藥劑防治，對西瓜的質(zhì)量安全及生態(tài)環(huán)境安全影響較大，同時(shí)也導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成藥劑過量的惡性循環(huán)。因此，篩選抗病材料、選育抗病品種是目前西瓜炭疽病生產(chǎn)上亟待解決的問題。

建立可靠的人工接種方法是西瓜炭疽病抗性鑒定與評價(jià)的前提。目前，針對西瓜炭疽病的接種及評價(jià)方法主要有活體植株噴霧鑒定及分級(jí)評價(jià)法[4、6]、離體葉片接種鑒定及AD評價(jià)法[7]。本研究取西瓜植株完全展開的第四片真葉，配置孢子濃度為1×106mL-1的懸浮液，利用微量移液器在每個(gè)接種點(diǎn)接種10 μL的長嶺西瓜炭疽病菌孢子液，每個(gè)葉片根據(jù)大小接種3～5個(gè)點(diǎn)，在溫度 25 ℃，濕度為90%的光照培養(yǎng)箱中保持黑暗48 h后給予正常的光照，5 d后調(diào)查發(fā)病情況，利用平均病斑直徑及發(fā)病率進(jìn)行鑒定評價(jià)，可以較好的區(qū)分不同西瓜種質(zhì)材料對長嶺西瓜炭疽病的抗性表現(xiàn)。利用該接種方法，共篩選獲得西瓜炭疽病免疫材料1份(PI368509)、抗病材料1份(PI278038)、中抗材料1份(Sun sweet)(表1)，可為選育抗病、優(yōu)質(zhì)的西瓜品種提供材料基礎(chǔ)。

相比活體噴霧法[4、6]，本研究方法具有不損傷植株、節(jié)省菌液、不會(huì)產(chǎn)生病原菌擴(kuò)散的優(yōu)點(diǎn)；與文生倉等[7]所報(bào)道的利用微量注射器的懸滴法相比，該研究方法具有接種標(biāo)準(zhǔn)一致(即每個(gè)接種點(diǎn)接種10 μL的孢子懸浮液)，可定量進(jìn)行鑒定評價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。此外，本研究對平均病斑直徑和發(fā)病率進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.88，呈顯著正相關(guān)，說明利用平均病斑直徑和發(fā)病率進(jìn)行離體葉片抗性鑒定評價(jià)是可靠的。綜上，西瓜離體接種鑒定方法(點(diǎn)滴法)可為西瓜炭疽病的抗性鑒定提供新的技術(shù)參考。