小鼠膀胱癌正位模型的建立及納米載藥體系研究

于肖肖，李丹丹，高基民

(溫州醫科大學檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

膀胱癌是全世界第9種常見的惡性腫瘤，也是第13種最常見的癌癥死亡原因[1-2]。監測膀胱癌治療效果需要合適的動物模型，傳統的監測技術需要將動物處死，而近十幾年來得到快速發展的小動物活體成像技術解決了這個問題。生物發光成像技術(BLI)是一種非侵入性的實時可視化成像模型，可以在細胞、分子或基因水平上檢測生物體內的生理或病理變化[3]。納米載藥體系近幾年來發展迅速，納米材料可以包載小分子物質靶向運送至腫瘤部位，提高治療效果[4-5]。本研究構建了穩定表達熒光素酶的膀胱癌細胞MB49細胞系，構建了小鼠膀胱癌皮下模型，用明膠包裹的單壁碳納米管作為納米載藥體系，包載鼠粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(mGM-CSF)和阿霉素(DOX)，通過小鼠眼眶靜脈進行治療，同時對小鼠進行近紅外光照射治療，以期達到光熱、免疫、化療聯合治療的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

MB49細胞是小鼠膀胱癌細胞株，購自中國科學院。

1.1.2 試劑

1640培養基、胎牛血清、嘌呤霉素，美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素溶液，中國碧云天公司。

1.1.3 試驗動物

C57BL/6小鼠和BALB/C裸鼠購自上海斯萊克動物中心，雌性，6～8周齡，飼養于溫州醫科大學SPF級實驗室，獨立送風柜中飼養，自由飲水和進食。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質粒的構建

選擇實驗室保存的質粒PcDNA3.1-FLAG-Luc2GFP為模板，設計PCR引物(F：5-CGAGAC TAGTTCTAGGCCACCATGGAAGATGC-3，R：5-TTG CGGCCGTCTAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3)，由上海桑尼公司合成。PCR反應體系為25 μL，反應條件為：98 ℃變性10 s；60 ℃退火15 s，68 ℃延伸2.5 min，共30個循環。通過膠回收得到Luc2GFP片段，用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ對載體質粒pLVX-EF1a-IRES-Puro進行酶切，得到線性的質粒pLVX-EF1a-IRES-Puro，和Luc2GFP進行無縫克隆，用trans 5ɑ進行轉化，提取質粒，用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ進行酶切鑒定，取鑒定符合預期的克隆進行測序。

1.2.2 穩定表達熒光素酶的膀胱癌MB49-Luc細胞的構建

利用實驗室的慢病毒包裝平臺，對pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質粒進行包裝，得到慢病毒，利用慢病毒感染MB49細胞，用2 μg·mL-1嘌呤霉素進行篩選，通過流式細胞術單細胞分選技術得到單個MB49-Luc細胞，擴增培養，通過流式細胞術和免疫印跡來篩選出能夠表達熒光素酶和綠色熒光蛋白的細胞，用于后續動物試驗。

1.2.3 小鼠膀胱癌正位模型的構建

BALB/C雌性裸鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉150 μL，待小鼠呼吸平穩后，將小鼠放于無菌紙墊料上，用酒精棉球對小鼠外尿道口處進行消毒。將液體石蠟中浸泡過的一次性靜脈留置針軟管沿著小鼠尿道外口插入膀胱，用PBS沖洗3次，注入100 μL配制好的0.1 mol·L-1HCl，待留置20 s后，吸出50 μL棄掉，迅速注入50 μL 0.1 mol·L-1NaOH并留置5 s，然后全部吸出，用PBS沖洗3次，排空膀胱，注入100 μL 0.2×106MB49-Luc細胞，然后留置于膀胱2 h。

1.2.4 納米載藥體系治療小鼠

將6～8周齡C57BL/6雌性裸鼠皮下注射2×106MB49-Luc細胞，7 d后小鼠皮下成瘤。將小鼠分為4組，每組5只，分別為PBS組、Gel@SWCNTs-DOX組、Gel@SWCNTs-GMCSF組、Gel@SWCNTs-DOX-GMCSF組。對小鼠腫瘤內注射100 μL治療材料，30 min后NIR(1 W·cm-2)照射腫瘤2 min治療，4 d后活體成像監測腫瘤治療效果。

2 結果與分析

2.1 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質粒的構建

以質粒PcDNA3.1-FLAG-Luc2GFP為模板，PCR擴增出Luc2GFP片段(圖1)。

圖1 Luc2GFP基因凝膠電泳的結果

將載體質粒pLVX-EF1a-IRES-Puro用限制性內切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切后，切膠回收，與PCR得到的Luc2GFP基因片段進行無縫克隆。將連接后的產物轉化入trans 5ɑ，提取質粒，用限制性內切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ進行酶切鑒定，得到2個大小為8.9 ku和2.4 ku的片段，說明成功構建了pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質粒(圖2)。

圖2 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質粒酶切的結果

2.2 穩定表達熒光素酶的膀胱癌MB49-Luc細胞的構建

利用流式細胞術檢測到MB49-Luc細胞中Luc和GFP的表達達到93.8(圖3)。Western blot檢測發現，重組細胞中Luc和GFP均有表達(圖4)。

圖3 流式細胞儀檢測的結果

圖4 Western blot檢測的結果

2.3 小鼠膀胱癌正位模型的構建

通過留置針將MB49-Luc細胞注入6～8周的BALB/C雌性裸鼠膀胱內，分別在第11天和第20天觀察，結果顯示，小鼠膀胱癌正位模型構建成功(圖5)。

圖5 小鼠膀胱癌正位模型的活體成像

2.4 納米載藥體系對小鼠的治療效果

如圖6所示，與對照組PBS相比，各處理對小鼠腫瘤均有一定的治療效果。

圖6 不同處理組小鼠腫瘤的生長情況

3 討論

納米材料種類繁多，如脂質體、碳納米管、聚合物納米粒子、聚合物膠束、固體脂質納米粒、囊泡、樹枝狀聚合物及硅、金、銀等金屬納米粒子[6]。納米載體的粒徑一般為1～1 000 nm[7]，其中單臂碳納米管因其自身的特性被廣泛關注[8-9]，同時也有高度疏水性和細胞毒性等缺點[10-11]，實際使用中可利用明膠來修飾單臂碳納米管，降低其疏水性和細胞毒性[12-13]。

粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是具有二硫鍵的酸性糖蛋白[14]，可以刺激產生大量造血和非造血細胞，激活和引發髓樣細胞群產生炎癥介質，具有促炎細胞因子的作用[15-17]。阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種蒽環類化合物，用于治療血液惡性腫瘤、軟組織肉瘤等多種癌癥，且對實體瘤具有顯著活性[18]。利用明膠修飾的單臂碳納米管來包載GM-CSF，DOX對小鼠膀胱癌進行治療，同時利用近紅外光進行光熱治療，促進納米載藥體系包載物質的釋放，提高腫瘤部位藥物濃度，并利用活體成像對治療效果進行縱向監測，結果顯示，納米載藥體系對小鼠膀胱癌有一定的治療效果，為后續膀胱癌的治療研究提供參考。