載三氧化二砷PLGA微球的制備與體外釋放對肝癌的影響

吳育民 杜端明 陳娟萍 劉春霖

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)是中藥砒霜的主要有效成分[1]。最早是治療瘧疾、結(jié)核病和梅毒的輔助藥物，后來被用于治療急性早幼粒白血病，取得了一定的療效，接著發(fā)現(xiàn)三氧化二砷對肝癌和肺癌等腫瘤也有一定的抑制作用，并開發(fā)了三氧化二砷注射液用于臨床治療[2-4]。三氧化二砷能夠影響細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移，還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能通過下調(diào)Bcl-2/bax 基因的表達(dá)，使線粒體膜PT 通道開放，釋放Cyto-C、AIF、鈣離子等凋亡激發(fā)因子使細(xì)胞走向凋亡[5-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷能促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，干擾內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，間接抑制腫瘤生長[8-10]。

三氧化二砷雖然能夠抑制腫瘤生長，但也存在許多問題。首先是毒副作用，三氧化二砷在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對正常細(xì)胞損傷較大，具有較強(qiáng)的毒性，其次三氧化二砷水溶性較小，給藥時(shí)容易析出。因此有必要改進(jìn)藥物給藥方式，構(gòu)建藥物載體，更好地更高效低毒地進(jìn)行藥物控制給藥。乳酸/羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glyconlic acid，PLGA)由乳酸和羥基乙酸縮合而成，可經(jīng)人體正常代謝，最終降解為H2O和CO2，因此幾乎對生物體無毒副作用[11]，具有良好的生物相容性和可降解性，可應(yīng)用于藥物載體研究，該微球體系對包埋的藥物具有保護(hù)作用，并能夠靶向到到某些特殊，控制藥物釋放，延長藥物作用時(shí)間，降低藥物毒性和刺激性等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。因此本研究摸索了PLGA微球的制備方法，并將As2O3成功包埋在PLGA 微球里，并進(jìn)行相關(guān)表征，模擬體內(nèi)環(huán)境控制釋放As2O3，為進(jìn)一步的載As2O3PLGA 微球體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑。PLGA：aladdin P133293；三氧化二砷：北京雙鷺?biāo)帢I(yè)； 20170701；PVA：aladdin P105126；二氯甲烷：AR 500 ml；PBS：Solarbio 20171211。

儀器。冷凍干燥機(jī)：上海比朗 FD-1A-50；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：山東博科RE-501；勻漿機(jī)：新芝 S10；恒溫水浴鍋：鄭州宏朗 HH-2；藥品冷藏柜：歐寶科技 SF-477S；溫控?fù)u床：太倉THZ-98；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)：美國PE公司optima 8000；激光粒度儀：馬爾文Zetasizer nano zs90。

1.2 載As2O3的 PLGA 微球制備

采用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法，將200 mg PLGA溶解在10 ml二氯甲烷溶液中，將 10 mg As2O3加入上述溶液中，用手持式勻漿機(jī)在5 000 rpm高速攪拌10 s，形成初乳溶液；迅速將初乳溶液倒入10 ml 3% PVA中，冰浴下10000 rpm勻漿攪拌10 s，形成復(fù)乳溶液;將復(fù)乳溶液倒入500 ml 0.5% PVA中，室溫下磁力攪拌2 h,減壓蒸餾6 h去除其中殘余的有機(jī)溶劑，5 000 rpm離心15 min,去離子水洗3次，將沉淀冷凍干燥可得到 PLGA 微球載As2O3，4 ℃保存。

采用同樣的方法制備不加藥物的空白 PLGA 微球粉末。

1.3 載As2O3的PLGA粒徑測定

稱取一定量載As2O3的PLGA微球(或空白PLGA微球)溶于含0.5% Tween 80的水中使得濃度為1 mg/ml，超聲分散10 min后立即用激光粒度儀測定粒徑。

1.4 載As2O3的PLGA 微球體外釋放

取制備好的載As2O3的PLGA微球溶于3 ml PBS中溶解混勻混勻，37 ℃條件下，200 rpm震蕩培養(yǎng)，每隔24 h取樣，3 000 r/min離心5 min取上清與4 ℃保存，并補(bǔ)液3 ml繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)19天取樣。連續(xù)取樣完成后，利用ICP-MS測定砷含量換算成As2O3的含量，繪制釋放曲線。

1.5 兔肝癌模型造模

VX2 細(xì)胞培養(yǎng):從液氮中取出凍存管、用PE手套包裹后用鑷子迅速將其置于38 ℃～40 ℃溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1 min之內(nèi)融化,打開凍存管，迅速將細(xì)胞懸液吸到已經(jīng)裝有10 ml特定培養(yǎng)基的離心管中，混勻?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況，換液繼續(xù)培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清，PBS洗兩遍，0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化3 min，加入DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化并懸起細(xì)胞；收集細(xì)胞至離心管中，1 000 rpm離心3 min，棄盡上清，加入 DMEM 高糖培養(yǎng)基吸管吹勻；將上述細(xì)胞懸液稀釋至適宜細(xì)胞密度后加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，于37 ℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

腫瘤細(xì)胞接種:收集生長狀態(tài)良好的VX2細(xì)胞，消化懸浮后接種在新西蘭兔右側(cè)后腿，1～2周后基本形成腫瘤，之后后進(jìn)行肝癌模型造模。

兔肝癌模型建立:將成瘤后新西蘭兔的腫瘤取下，裁剪成2～3 mm3大小瘤粒。麻醉移植兔子，劍突下約2 cm開口，將肝臟暴露在視野下，用顯微鑷子夾起瘤塊，包埋在肝臟中，深約1 cm，待肝臟無瘤粒溜出、無出血，關(guān)閉腹腔，縫合。

2 結(jié)果

2.1 載As2O3的PLGA微球制備

載As2O3的 PLGA 微球以及空載的PLGA微球掃描電鏡圖片，都是均勻的圓球狀，大小均勻，形狀規(guī)則穩(wěn)定。空載的PLGA微球更加的光滑，載 As2O3的 PLGA 微球表面較為粗糙，有的還有部分凹陷，但更為均一。

2.2 載As2O3 的PLGA微球粒徑測定

如下圖1所示，兩種微球粒徑的比較，可以觀察到粒徑差距不大，主要均分布在20～30 μm之間，說明包埋 As2O3之后的PLGA微球幾乎不受影響，與空載微球相差無異。顯示了PLGA微球良好的穩(wěn)定性和優(yōu)異的藥物包埋能力。

2.3 載 As2O3 的PLGA 微球體外釋放

圖2顯示的是載 As2O3的PLGA 微球體外釋放的累計(jì)釋放曲線，隨著時(shí)間進(jìn)行 As2O3緩慢均勻的從 PLGA 中釋放出來，逐漸增多。由圖2可以看出一開始釋放速率較快，隨后逐漸減緩直至釋放完全。載As2O3PLGA微球體外釋放在15天趨近于釋放完全。

3 討論

三氧化二砷擁有良好的抗腫瘤效果，廣泛地應(yīng)用于各種實(shí)體瘤及白血病的治療，但由于其水溶性和毒副作用限制了其更加廣泛和高效率的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用PLGA微球作為藥物載體進(jìn)行包埋As2O3，制備成載As2O3的 PLGA 微球制劑，實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放，降低As2O3的毒性，提高As2O3的利用率。

首先，我們通過優(yōu)化工藝改善制備條件，采用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法制備了均一穩(wěn)定的PLGA微球，并通過在制備微球過程中加入了As2O3，實(shí)現(xiàn)了包埋As2O3的PLGA微球的制備，掃描電鏡分析載As2O3的PLGA微球與空載的PLGA微球相比，差別不大，只是略微的微球表面粗糙，個(gè)別微球表面凹陷，宏觀觀察呈白色粉末(空載PLGA也呈白色粉末狀)，表明As2O3已經(jīng)被包埋進(jìn)去。激光粒度儀對空載和載 As2O3的PLGA微球進(jìn)行表征，粒徑大部分集中在20～30 μm之間，并沒有因?yàn)?As2O3而改變，說明了PLGA良好的藥物包埋能力和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

圖1 PLGA微球粒徑測定

圖2 載As2O3 PLGA微球體外釋放曲線

進(jìn)一步模擬體內(nèi)環(huán)境的As2O3藥物緩釋，在37 ℃條件下，200 rpm震蕩培養(yǎng)，每天定時(shí)取樣，連續(xù)19天不間斷，采用ICP-MS檢測As的含量，換算成As2O3的含量，從而可以算出As2O3每天的累計(jì)釋放量，并繪制釋放曲線。隨著時(shí)間進(jìn)行As2O3緩慢均勻的從PLGA中釋放出來，逐漸增多。由圖可以看出一開始釋放速率較快，隨后逐漸減緩直至釋放完全。載As2O3PLGA微球體外釋放在15天趨近于釋放完全。相比于游離的藥物，微球載藥的控制釋放極大地提高了As2O3的利用率，也減少了它的毒副作用。

對新西蘭兔進(jìn)行肝癌動物模型造模，首先是培養(yǎng)VX2細(xì)胞，之后接種新西蘭兔成瘤，最后去腫瘤植入肝臟，肝癌模型造模。目前為止造模成功，下一步的研究將載As2O3PLGA微球用于肝癌的治療中。

致力于開發(fā)新型的給藥方式、新劑型一直是許多研究者關(guān)于如何利用As2O3的不懈追求，最大限度提高 As2O3的藥物利用率，減少它的副作用，是我們研究者的最終目標(biāo)[14-15]。我們提供的載As2O3PLGA微球在體外環(huán)境下顯示了良好的藥物緩釋性能，為接下來的載As2O3的PLGA體內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)提供重要的支撐。