核酸適配體生物傳感器在食品霉菌毒素檢測中應用的研究進展

喬勤勤,文 芳,鄭 楠,薛秀恒,程建波,張 昊,李松勵,王加啟

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,動物營養學國家重點實驗室, 農業農村部奶產品質量安全風險評估實驗室(北京),北京 100193; 2.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽農產品加工工程實驗室,安徽合肥 230036;3.安徽農業大學動物科技學院,安徽合肥 230036)

霉菌毒素是由霉菌產生的次級代謝物,通過污染飼料和動物性食品(肉、蛋、奶等),對動物生產性能以及人類的組織和器官產生極大的危害[1-2]。谷物在生長、收獲、儲藏或加工過程中容易被霉菌毒素污染,世界上每年大約有 25% 的谷物遭受霉菌毒素的污染,嚴重影響人們健康飲食同時也造成巨大的經濟損失[3-4]。食品中霉菌毒素污染已成為我國乃至全世界重點關注的問題之一,所以研發出簡便、快速、靈敏的霉菌毒素檢測方法對于食品安全和檢測方面具有重要意義。近些年來,核酸適配體檢測技術因具有高親和力、高特異性、穩定性好、易修飾等優點得到快速發展,目前已經研發出的核酸適配體檢測方法成功應用于食品中霉菌毒素的檢測[5]。

本文介紹了我國和其他國家對食品中部分霉菌毒素的限量規定及其危害,簡要概括了基于SELEX技術篩選核酸適配體的過程,詳細地敘述了基于核酸適配體的生物傳感器在食品中檢測霉菌毒素的相關應用,總結出核酸適配體研究現狀,進一步指出該研究現狀的發展趨勢以及對后續研究的借鑒意義。

1 食品中霉菌毒素限量規定及其危害

目前有400多種已知的霉菌毒素對人類和動物具有潛在毒性,常見的霉菌毒素主要包括黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)、赭曲霉毒素(Ochratoxin A,OTA)、伏馬菌素(Fumonisin B1,FB1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)以及T-2毒素(Mitsubishi T-2)[6-7]。霉菌毒素是人類健康的主要威脅之一[1],AFB1是一種高毒性的食品污染物,已被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為第1類致癌物[8-9]。OTA對大多數哺乳類動物有高度的致肝癌、致腎癌、致突變和致畸形等[10]。ZEN及其代謝物會影響雌性激素分泌,尤其是在哺乳動物生殖過程中[11]。T-2毒素可抑制蛋白質以及DNA和RNA的合成[12]。因為在自然條件下霉菌毒素天然存在,所以農作物在加工、運輸和儲存中容易被霉菌毒素污染[13]。因此,只要條件(濕度和溫度)合適,霉菌毒素會污染食品、農作物和飼料[14]。對含有相對較高霉菌毒素水平的母牛飼料的研究表明,霉菌毒素及其代謝產物可轉移到相應的食品中[15]。為了保護消費者的健康和減少經濟損失,我國標準GB 13078-2017[16]中明確規定奶牛飼料中霉菌毒素最大殘留限量(表1),標準GB 2761-2017[17]對食品中部分霉菌毒素的限量做出了相關規定(表2),歐洲委員會(European Commission)[18]和國際癌癥研究組織[19]規定了大多數食物中霉菌毒素限量標準(表3)。

表1 我國標準GB 13078-2017中規定奶牛飼料中霉菌毒素最大殘留限量

表2 我國標準GB 2761-2017規定了食品中部分霉菌毒素的限量

表3 歐洲委員會和國際癌癥研究組織對部分霉菌毒素的限量規定

2 霉菌毒素檢測方法

2.1 霉菌毒素傳統檢測方法

傳統檢測霉菌毒素的方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)和質譜法(MS)等儀器分析方法以及基于抗體的酶聯免疫反應(ELISA)、免疫傳感器和表面等離子共振(SPR)等免疫分析方法[20-24]。儀器分析方法具有較高的靈敏度、特異性和重復性等優點,免疫分析方法操作便捷、快速以及樣品需要少等,但這些檢測方法仍然存在一些問題,比如在儀器分析方法在樣品前處理過程中,步驟繁雜、耗時長且不適合現場操作,同時需要大量的專業技術人員,而免疫分析方法中使用的抗體價格昂貴且不穩定,制備時間長,不容易長期存儲,檢測的結果容易出現假陽性、假陰性等[25-26]。所以研發出簡單、便捷、靈敏的霉菌毒素的檢測方法顯得尤為重要。

2.2 霉菌毒素生物傳感器檢測

目前,基于核酸適配體的生物傳感器因具有易合成、易標記、易修飾、靈敏度高、特異性高、分子量小、檢測成本低等優勢而受到廣泛的關注[27-28]。國際理論與應用化學聯合會(IUPAC)對生物傳感器的定義為利用全細胞、細胞器、組織、酶或免疫制劑等生物識別元件的特異性生化反應,借助電、光、熱等各種信號對化學物質進行檢測的一類裝置[29]。其優點是特異性好、靈敏度高、檢測快速、樣品前處理簡單且可操作性強,在食品分析、醫學檢驗、環境監測、工業檢測與控制等領域具有廣泛的應用[30]。最常用的生物識別元件為核酸適配體、抗體和酶[31-32]。

2.3 生物傳感器中核酸適配體的篩選

核酸適配體是在體外篩選,能高親和力和高特異性結合目標物的單鏈寡核苷酸序列(單鏈DNA(ssDNA)或RNA),最早由Tuerk等[33]發現,由Ellingtin等[34]命名。核酸適配體一般由20～100個核苷酸組成,其相對分子質量小、性質穩定、易穿透細胞膜,可通過重復的變性循環來維持其結構,可用于檢測多種目標物,包括蛋白質、霉菌毒素、農獸藥和金屬離子等[35-38]。核酸適配體篩選技術基本上都是通過指數富集的配基系統進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)完成的,主要過程包括結合、分離、洗脫、擴增和調節[39]。幾乎所有通過SELEX篩選的適配體在微摩爾(μmol)至納摩爾(nmol)范圍內的解離常數(Kd)都表現出高親和力。因此,適配體也被稱為“化學抗體”[40]。基于抗體的篩選方法具有操作簡便、靈敏等優點,但在運輸和儲存過程中抗體穩定性較差的問題意味著該技術僅限于高度嚴格控制的環境中[41]。具有與抗體相似功能的核酸適配體,因具有成本低、穩定性高、易修飾、易合成、不需要活體動物或細胞、反復使用、可長期保存等優點,漸漸將抗體取代[42-43]。此外,當核酸適配體作為實時定量聚合酶鏈式反應(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)中的模板,可使核酸適配體以指數形式擴增,以大大提高檢測靈敏度[44]。因此,在許多生物學應用中,核酸適配體被認為是抗體的更好替代物[45]。

核酸適配體一般是通過SELEX篩選得到的,其篩選過程是從隨機寡核苷酸文庫開始,篩選的復雜度和多樣性取決于其隨機核苷酸的數目。在SELEX篩選過程中,隨機寡核苷酸文庫在pH、離子強度和溫度的作用下暴露于靶標,與非結合物分離洗脫,對靶標具有親和性的寡核苷酸進行PCR擴增。然后對從第一輪篩選產生的富集池進一步選擇循環,用于增加反應池對靶標的親和力(即正篩選)或消除可能與其它相關化合物交叉反應的成員池(即負篩選)。經過數輪篩選后,對富集的核苷酸文庫進行測序和表征,通過測定Kd來評估適配體的親和力,篩選出高親和力的核酸適配體。在這些序列被測序之后,可化學合成大量高純度的目的核酸適配體序列,以便并入感興趣的生物傳感器平臺中,同時也可對靶標或者適配體進行各種的修飾,以便得到高靈敏、高選擇的核酸適配體生物傳感器[46]。隨著分子生物學技術的快速發展,核酸適配體檢測技術在食品安全檢測、臨床診斷、生物分析以及環境污染物監測等領域得到了廣泛的應用,表4列舉了目前文獻中報道的常見霉菌毒素(AFB1、AFM1、OTA、FB1、ZEN)的核酸適配體序列。

表4 常見的霉菌毒素的核酸適配體序列

3 基于核酸適配體的生物傳感器檢測食品中霉菌毒素的方法

食品中的霉菌毒素污染一直是全球關注的問題。近年來由于基于核酸適配體的生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、成本低和便于攜帶等優點被廣泛關注,目前已有部分核酸適配體檢測技術成功應用于食品和飼料中霉菌毒素的檢測。表5列舉了基于核酸適配體的生物傳感器檢測AFB1、AFM1、OTA、FB1、ZEN的方法。

表5 基于適配體的生物傳感器檢測霉菌毒素的方法

3.1 在AFB1檢測中的應用

AFB1是毒性最強的霉菌毒素之一,引起了全球食品安全領域的廣泛關注。在食品和農產品檢測中,時常發現AFB1的存在,尤其是在花生、玉米、飼料及谷物作物中[59]。為了使人類健康免受AFB1的危害,許多國家都制定了相關限量,如歐盟委員會規定所有谷類及谷類相關食品中AFB1含量不超過2 μg/kg[73]。為了阻止污染食品帶來的食品安全恐慌和經濟損失,開發出快速檢測AFB1的核酸適配體傳感器顯得極其重要。

Chen等[74]開發了能快速、靈敏檢測AFB1的熒光傳感器,首先將將熒光修飾的適配體與其修飾淬滅基團的互補DNA雜交,熒光因適配體靠近淬滅基團而被淬滅;當體系中加入AFB1后,適配體與AFB1結合形成適配體/AFB1復合物導致適配體結構發生改變,從而釋放cDNA,使適配體恢復熒光。通過監測熒光值的變化定量分析AFB1的濃度,在優化條件下,該方法的檢測范圍為5～100 ng/mL,檢出限為1.6 ng/mL;該檢測方法應用到不同品牌的嬰幼兒配方米粉中,其回收率為93.0%～106.8%。Sun等[75]開發了基于適配體表面等離子體共振的生物傳感器,可用于直接定量分析AFB1,首先將鏈霉親和素固定在SPR芯片表面上,然后通過鏈霉親和素與生物素之間強相互作用,捕獲到生物素化的適配體;AFB1與SPR芯片上適配體的結合導致質量濃度發生變化,進而使SPR芯片上有明顯反應;將適配體固定在SPR芯片表面上,監測AFB1與適配體在SPR芯片上的結合程度,可實時監測AFB1的濃度。該方法測定AFB1的濃度范圍為0.4～200 nmol/L,其檢出限為0.4 nmol/L。在復雜的樣品基質中測定AFB1,例如稀釋100倍的紅葡萄酒和50倍的啤酒,其檢測的回收率范圍為87%～102%。該SPR傳感器穩定可重復使用并有實時、靈敏度高、特異性強和高通量等優點。

Hosseini等[47]開發了一種以未修飾的金納米顆粒(AuNPs)作為指示劑,AFB1適配體作為特異性識別元件的比色適配體傳感器,在AuNPs表面上,AFB1結合適配體產生的解吸作用引起了AuNPs的聚集,使適配體與靶標相互作用,導致AuNPs的顏色從紅色變成紫色。該傳感器檢測AFB1濃度的線性范圍為80～270 nmol/L,檢測限為7 nmol/L。此外,聚集的AuNPs的催化活性大大增強了化學發光反應,其中檢測限為0.5 nmol/L,回歸系數R2=0.9921;該方法對AFB1檢測具有較高的靈敏和選擇性,避免了AFB2、AFM1、AFG2、AFG1和OTA等常見霉菌毒素的干擾。Mukherjee等[48]研究了一種以基于AFB1特異性適配體與AFB1半抗原偶聯物之間的熒光競爭性反應的檢測方法,可用于快速、靈敏以及高通量檢測AFB1,在最佳條件下,檢測的線性范圍為50 pg/mL～50 ng/mL,檢測限為10 pg/mL;并以干紅辣椒、花生和全椒為例驗證該試驗,在10 ng/mL和100 pg/mL水平下其回收率為92%～102%。

這些檢測方法具有靈敏度高、特異性強和高通量等優點,也為之后適配體傳感器發展提供了研究和探索的方向,但它們也存在一些不足,比如不能便攜,不能更好地應用現場檢測,對于實際樣品中的AFB1的檢測也不具有普遍適用性。所以為了更好的應用到實際生活中,需開發操作簡單、便攜、靈敏度更高的適配體傳感器。

3.2 在AFM1檢測中的應用

AFM1是源自肝細胞色素P450相關酶活性的AFB1羥基化代謝產物,可從攝入黃曲霉或寄生蟲污染的動物性食品的家畜生產的奶或乳制品中發現[19,64]。在歐洲,牛奶中AFM1的濃度不得超過0.05 μg/kg,中國和美國規定牛奶中AFM1的濃度必須低于0.5 μg/kg[76-77]。所以開發出快速、靈敏的適配體傳感器檢測食品中AFM1極其重要。

Sharma等[78]利用熒光標記的AFM1適配體與TAMRA標記的互補DNA序列雜交,熒光基團和猝滅劑緊密接近導致熒光猝滅。在添加AFM1后,靶向誘導的反平行G-四鏈體適配體-AFM1復合物構象形成導致熒光恢復。在優化條件下,AFM1檢出限為5.0 ng/kg。該檢測方法已經應用于加標牛奶樣品中AFM1的檢測,回收率為94.40%～95.28%(n=3)。Khoshfetrat等[8]研究了一種用封閉雙極電極(BPE)陣列檢測AFM1的電化學發光(ECL)適配體傳感器,將硫醇化的AFM1適配體固定在金納米顆粒磁性Fe3O4納米顆粒(Apt-GMNPs)上,之后將功能化納米銀修飾的石墨烯氧化魯米諾(GO-L-AgNPs)通過未配對堿基的π-π相互作用連接到固定適配體(Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs)上,將Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs引入金陽極BPE陣列后,使各個電極經受不同濃度的AFM1,在AFM1與適配體相互作用后,GO-L-AgNPs從適配體上分離,用光電倍增管(PMT)或智能手機監測陽極中魯米諾和H2O2的ECL,并用軟件分析圖像,在最佳條件下,基于PMT的BPE-ECL適配體傳感器檢測在5～150 ng/mL寬動態范圍內呈線性關系,檢測限為0.01 ng/mL;此外,基于智能手機的檢測結果顯示ECL圖像灰度值與AFM1靶標對數濃度在10～200 ng/mL范圍內呈線性關系,檢出限為0.05 ng/mL。

Guo等[79]開發了一種用于檢測AFM1的靈敏可靠的適配體傳感器,通過生物素-鏈霉親和素強相互作用使適配體在鏈霉抗生物素包被的PCR管表面上固定,作為PCR擴增模板的互補ssDNA與單鏈適配體部分雜交形成dsDNA,dsDNA在無AFM1體系下具有穩定性,在添加AFM1后,適配體和AFM1之間的結合誘導適配體構象發生變化,使互補ssDNA釋放以及模板數量減少,因此,該適配體傳感器可通過監測PCR擴增信號強弱變化定量測AFM1的濃度;在優化條件下,使AFM1濃度在1.0×10-4～1.0 μg/L范圍內呈現線性關系,檢測限低至0.03 ng/L。該方法已成功應用于嬰幼兒谷物和奶粉樣品中AFM1的定量測定。陳璐[25]設計了一種基于結構轉換的熒光適配體傳感器用于檢測AFM1,用FAM修飾適配體,同時用TRAMA修飾cDNA。當體系中不存在AFM1時,適配體與cDNA雜交,由于適配體與cDNA相互靠近,導致適配體的熒光被淬滅;當體系中加入AFM1后,AFM1更易于與適配體結合,形成AFM1/aptamer復合物,導致適配體結構發生改變,從而釋放cDNA;當cDNA遠離適配體后,適配體熒光恢復;在最優條件下,檢測到的熒光值與AFM1濃度在5～100 ng/mL之間呈線性關系,檢出限為1.7 ng/mL。

這些檢測方法具有操作簡單、靈敏度高等優點,但不能更好應用到實際樣品中AFM1的檢測,特別是奶及奶制品。在未來的研究中,需要提高適配體傳感器在實際樣品檢測中的靈敏度,解決因反應基質的不同導致適配體靈敏度降低的困難。

3.3 在OTA檢測中的應用

OTA對人體和動物具有潛在致癌性,能引起免疫抑制以及免疫毒性,目前由OTA引起的食品污染現象廣泛存在[38]。考慮到OTA的這些潛在毒性作用,歐盟委員會明確規定未加工谷物中OTA的最大限量為5 μg/kg,加工后的谷物為3 μg/kg,咖啡豆為10 μg/kg,葡萄酒為2 μg/mL[80]。為了避免OTA污染的風險,檢測和定量食品及其原料中OTA的含量具有重要意義,所以更加靈敏、快速的檢測OTA的核酸適配體傳感器不斷被研究出來。

Yue等[67]設計一種新型光子晶體編碼懸浮陣列適配體,可同時量化和鑒定谷類樣品中的OTA和FB1,將適配體通過化學鍵固定在光子晶體表面,當霉菌毒素出現在樣品中時,適配體熒光標記的互補DNA從雙鏈DNA雜交體中解離,導致熒光強度明顯下降;該傳感器以二氧化硅光子晶體微球(SPCM)的熒光強度差值定量霉菌毒素的濃度,再以SPCM的顏色或反射峰位置確定了霉菌毒素種類;該方法檢測的OTA范圍為0.01～1 ng/mL,檢測限為0.25 pg/mL,加標谷物樣品中OTA的回收率為81.80%～116.38%。Sun等[81]利用無固定化適配體-氧化石墨烯納米片與基于DNA酶I的循環信號放大相耦合的特點,開發了一種簡單可行的用于檢測食品中OTA的均相電化學傳感器;氧化石墨烯納米片與核堿基和芳族化合物的非共價結合使硫堇標記的OTA適配體附著于納米片的表面,再以帶負電的絲網印刷碳電極(SPCE)獲得的游離硫堇分子為電子信號;由于形成的硫蛋白適配體/石墨烯納米復合物懸浮在檢測溶液中并遠離電極,從而導致電子信號變弱;當添加OTA后,分析物與適配體反應并導致硫氧還原蛋白-適配體從氧化石墨烯納米片上解離;新形成的硫代-適配體/OTA容易被DNase I切割并釋放出OTA,可重新觸發硫堇-適配體/石墨烯納米復合物,并產生大量游離硫堇分子;游離的硫堇分子被負電荷的SPCE捕獲,每個分子都可以在施加電位內產生電化學信號;通過監測電流的變化,定量評估樣品中OTA的濃度;在最佳條件下,該傳感器檢測限為5.6 pg/mL。

Samokhvalov等[82]提出了一種以適配體為受體,以錨蛋白為模板作為增強子的熒光偏振適配體傳感器,這種方法利用增加結合和未結合熒光團的尺寸差異,通過熒光標記和游離的OTA與適配體之間的競爭性結合測定OTA;由于熒光標記的OTA與包含在錨定復合物中適配體的結合比與游離適配體結合產生了更高的偏振,這使得該傳感器檢測限降低至3.6 nmol/L,并能在15 min內完成測定;為了評估該方法對實際樣品的具有適用性,在加標白葡萄酒中檢出限為2.8 nmol/L,回收率為83%～113%。Modh等[83]開發了一種以適配體為輔助的基于實時PCR的靶向誘導解離方法;通過將OTA適配體固定在涂有d(T)25的磁珠(dT磁珠)上,并與適配體中OTA結合部分的互補序列用作dT磁珠和適配體序列之間的接頭,將適配體固定在dT磁珠上;當添加OTA時,由于靶向誘導解離作用,使適配體從dT磁珠中釋放,通過qPCR擴增定量適配體;該檢測方法的濃度范圍為0.039～1000 ng/mL,檢測限為0.009 ng/mL。Apta-qPCR檢測方法具有靈敏、穩定和選擇性,可用于檢測復雜樣品等優點。

目前研發的用于食品中OTA檢測的適配體傳感器種類繁多且操作簡單,并具有實際應用價值,如結合血糖儀檢測食品中OTA[84]。不過主要問題仍是在改變反應基質后,傳感器靈敏度降低,所以這也是今后研究的關注點之一。

3.4 在FB1檢測中的應用

FB1是伏馬毒素B系列中毒性最大的,可引起人體肝臟疾病和食道癌[85]。因此需要高靈敏、便捷、簡單的方法用于食品中FB1的檢測。Ren等[86]開發了一種一次性適配體傳感器裝置,將預處理的SPCE用帶孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜覆蓋,以構建具有常規三電極的微電池,之后在工作中的電極上電沉分散良好的金納米顆粒,作為硫醇化適配體固定的優良基質;由于單個金納米顆粒可以裝載大量對FB1特異性的硫醇化適配體,因此在SPCE上修飾AuNPs為適配體提供了豐富的結合位點,從而提供了一個3D感應界面,有效地提高了響應信號;在最佳條件下,FB1濃度與EIS信號在10 pg/mL～50 ng/mL呈現良好的線性關系,檢測限為3.4 pg/mL(S/N=3)。該傳感器裝置具有成本低、操作簡單、高靈敏度和試劑消耗少等優點。

Chen等[87]通過電化學阻抗譜開發了一種基于適配體的生物識別方法,將FB1的硫醇化適配體錨定在玻碳電極上的金納米顆粒表面;當FB1濃度為0.1 nmol/L～100 μmol/L,FB1濃度與電阻數值呈線性關系,且檢測限為2 pmol/L;該測定法可用于加標玉米樣品中FB1的測定,回收率為91%～105%。桂海孌等[88]利用非標記熒光染料PicoGreen特異性識別適配體,建立了一種快速、高效檢測FB1的方法,利用適配體的選擇性以及PicoGreen與雙鏈DNA結合的特異性,通過熒光信號變化確定樣品中FB1濃度,實現了快速定量檢測FB1的目的;整個檢測流程可在40 min內完成,線性范圍為0.1～1μg/L,檢測限為0.1 μg/L。Yue等[67]設計了一種以適配體為基礎并由光子晶體編碼的懸浮陣列,可同時定量和定性檢測OTA和FB1。該方法對FB1的檢測范圍為0.001～1 ng/mL,檢測限為0.16 pg/mL,加標谷物樣品中FB1的回收率為76.58%～114.79%。

這些傳感器具有操作簡單、靈敏度高和親和力高等優點,其中研發的同時檢測兩種霉菌毒素的適配體傳感器對之后同時檢測多種霉菌毒素的傳感器的發展提供了新的探索思路和方向。

3.5 在ZEN檢測中的應用

ZEN是由鐮刀菌產生的非甾體雌激素霉菌毒素,可導致DNA損傷和染色體失常,并引起牛、豬和家禽等動物的生殖問題,甚至導致人類的生殖問題[85,89]。目前檢測食品中玉米赤霉烯酮的主要方法是儀器分析,該檢測方法不適合現場檢測,所以更需研發出高靈敏、簡便和快速的方法檢測食品中的ZEN。

Wu等[71]報道了一種基于上轉換納米顆粒(UCNPs)和磁性納米粒子(MNPs)的適配體傳感器,用于定量檢測ZEN。將適配體及其cDNA固定在MNP和UCNP表面上來制備發光生物測定平臺,然后將aptamer-MNPs和cDNA-UCNPs混合形成雙鏈體結構。當添加ZEN,適配體從cDNA上解離并優先結合ZEN,導致發射峰的熒光強度降低。結果表明,該檢測方法的檢測限為0.25 μg/L,在0.05～100 μg/L范圍內信號發光強度與ZEN濃度呈顯著的線性相關性(R2=0.9957)。Chen等[57]開發了一種基于磁珠分離/富集的簡單而快速的SELEX檢測方法。將ZEN包被的磁珠與ssDNA(0～1600 nmol/L)溫育60 min進行結合測定。通過熱處理洗脫磁珠結合的適配體,并測量ssDNA的濃度。經過14輪SELEX,篩選出最佳適配體并成功應用于實際樣品中ZEN的檢測。該檢測方法對ZEN的線性范圍為3.14×10-9～3.14×10-5mol/L,檢測限為0.785 nmol/L。

Wang等[58]通過利用單鏈DNA適配體和ZEN單克隆抗體(mAb-ZEN)具有高特異性和親和性的特點,開發了一種用于檢測玉米中ZEN的低氧免疫吸附測定方法。通過將純化的mAb-ZEN作為ssDNA識別的靶標,并包被在微量滴定板上。經過15輪篩選,獲得了對mAb-ZEN有最高親和力和特異性的適配體。該檢測方法的檢出限為0.01 ng/mL,檢測范圍為0.03～2.5 ng/mL,加標樣品的回收率為95%～105%。Goud等[72]開發了一種以功能性的氧化石墨烯作為FAM熒光猝滅劑為基礎的適配體傳感器方法。該方法測定ZEN的濃度范圍為0.5～64 ng/mL,檢測限為0.5 ng/mL。并成功地應用于測定加標的酒精飲料、啤酒和葡萄酒中ZEN,回收率為87%～96%,濃度范圍為1～16 ng/mL。目前對于ZEN適配體傳感器的研發較少,主要難題是篩選ZEN的適配體數目較少,對ZEN適配體傳感器的發展具有一定的局限性。

目前研發的ZEN適配體傳感器雖然靈敏度高、特異性高,但存在檢測操作繁雜,操作時間長等缺點。所以ZEN適配體傳感器的研究具有很大的發展空間。

4 結語與展望

近年來核酸適配體檢測方法的發展證明了核酸適配體檢測技術可作為取代食品中檢測霉菌毒素的常規檢測和分析方法,對于食品中其他小分子有害物質的檢測提供了新的思路和途徑。核酸適配體因具有易合成、易標記、易修飾、靈敏度高、特異性高等優點,使其在食品安全、醫學檢測、藥物分析和疾病診斷等領域發揮著重要的作用。目前核酸適配體廣泛應用于檢測霉菌毒素、金屬離子、微生物、蛋白質等目標物,而大多數文獻報道都以AFB1、AFM1、OTA和FB1為主,其他霉菌毒素核酸適配體的文獻報道幾乎沒有,所以篩選出其他霉菌毒素適配體及研發出相關適配體生物傳感器具有一定的挑戰性。

目前,已經開發出用于霉菌毒素的核酸適配體傳感器包括基于比色、熒光和PCR方法的傳感器[28,59,61],也存在耗時且不易執行的缺點,而且有些傳感器在使用時仍需要修改儀器的檢測步驟,導致操作步驟繁瑣,也存在損壞儀器的可能。在檢測食物樣品中霉菌毒素時,檢測體系中的反應基質會嚴重影響適配體靈敏度和準確性,特別是在測定食品中多種霉菌毒素時。通過簡化的樣品制備過程來降低基質效應,這也是核酸適配體檢測食品中霉菌毒素面臨的挑戰和今后發展的趨勢。盡管多數霉菌毒素核酸適配體已經得到應用,如試紙條,結合血糖儀檢測等,將這些核酸適配體作為實際應用的現場檢測工具仍有一定的難度,對于未來快速檢測食品中霉菌毒素提供了新的思路和挑戰。未來的研究可能集中研發便攜、親和力高、成本效益高的核酸適配體傳感器,使這些方法更適合于現場檢測。