微生物來源的β葡萄糖苷酶在食品工業中應用進展

張媛媛,蘇 敏,樸春紅,*,胡 洋,劉俊梅,薛艷杰,于寒松

(1.吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118;2.敦化市農業技術推廣中心,吉林敦化133700)

β-葡萄糖苷酶,又稱β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21),它可水解末端、非還原性的烴基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的β-D-糖苷鍵,同時釋放葡萄糖和相應的配基。作為纖維素酶系的重要組成部分[1],β-葡萄糖苷酶主要作用于β-1,4-葡萄糖苷鍵,也能作用于β-(1,1)、(1,2)、(1,3)、(1,6)糖苷鍵,能微弱地水解對硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷[2],該酶存在于幾乎所有的生物體內,是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一類酶。不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對分子量、結構和組成差異很大。已有研究報道,不同微生物所產的β-葡萄糖苷酶的相對分子量從幾十到幾百kDa[1],在碳水化合物活性酶數據庫(Carbohydrate-active enzymes database,CAZy)中,基于氨基酸序列的同源性和結構的相似性,將已知的β-葡萄糖苷酶分為7個家族:GH1、GH2、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116[3-5],不同來源的β-葡萄糖苷酶所屬的家族也不同,細菌、植物來源的β-葡萄糖苷酶屬于GH1家族,許多真菌來源的β-葡萄糖苷酶屬于GH3家族。

隨著國內外研究學者對β-葡萄糖苷酶的深入研究發現,微生物發酵產生的β-葡萄糖苷酶具有活性高、底物特異性強等特點,如青霉[6]、黑曲霉[7-9]等。同時,微生物發酵獲得的β-葡萄糖苷酶容易獲得高純度的酶制劑。因此近幾年微生物發酵生產β-葡萄糖苷酶的研究和應用越來越受到廣泛的關注。本文主要闡述生產β-葡萄糖苷酶微生物的主要來源和特性及其在食品加工中的應用進展,分析和指出目前存在問題和解決途徑。

1 β-葡萄糖苷酶的生產菌株

微生物來源的β-葡萄糖苷酶其數量龐大,價格低廉,制備容易而且用途廣泛。迄今為止,大規模生產的β-葡萄糖苷酶多數來源于自然界的微生物,主要集中在霉菌、酵母菌和細菌等。霉菌來源的β-葡萄糖苷酶研究較早,也比較充分。近幾年陸續有關于酵母菌如馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、細菌如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)產β-葡萄糖苷酶的相關研究。

1.1 霉菌來源

霉菌一直是產β-葡萄糖苷酶的一個重要來源,在工業中廣泛應用。包括黑曲霉、米曲霉、綠色木霉、青霉菌等。表1列舉了部分霉菌來源的β-葡萄糖苷酶酶學特性。從表1可以發現,大部分霉菌β-葡萄糖苷酶的最適溫度在40～60 ℃之間,最適pH大部分為酸性,一般在4.5～6.0之間,也有部分菌株所產的β-葡萄糖苷酶偏堿性。如毛霉菌(MucormieheiYH-10)[10]和米曲霉(Aspergillusoryzae)[11]分泌的β-葡萄糖苷酶的最適pH都達到8.0。近年來,耐熱的β-葡萄糖苷酶越來越受歡迎。彭利沙等[12]從綠色木霉(TrichodermavirideGIM3.139)中分離的β-葡萄糖苷酶最適溫度為80 ℃,隨著反應時間延長,在70～80 ℃條件下酶活可維持在90%,在80～95 ℃反應一段時間后,酶活雖有下降趨勢,但相對酶活仍維持在50%,具有較好的耐熱性;一些霉菌分離出的β-葡萄糖苷酶在寬范圍的溫度和pH下都有較好的穩定性。Abdella等[13]研究發現從耐高溫黑曲霉(AspergillusnigerNRRL3122)所分離出的β-葡萄糖苷酶最適pH為3.98,低于其他霉菌來源的β-葡萄糖苷酶,在pH為3時,其相對酶活仍能保持在70%以上。白葡萄酒釀造中,常常添加外源糖苷酶促進香氣濃郁的萜烯化合物的釋放[14],但是葡萄醪pH一般為3.0～3.5,因此耐酸性β-葡萄糖苷酶對葡萄醪中糖苷態的香氣前體物質的轉化具有重要的作用。Zhou等[15]從一種來源黑曲霉(AspergillusnigerSK34.002)的β-葡萄糖苷酶在55 ℃下孵育12 h后仍保持74%的酶活性,而且在4 ℃下儲存7個月后,它的酶活性幾乎保持不變,其顯著的熱穩定性和儲存穩定性在水解工業生產中非常有利。

表1 部分霉菌來源的β-葡萄糖苷酶的性質

不同來源的β-葡萄糖苷酶水解底物的類型也不同,如對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)、水楊苷、纖維二糖等。Xie等[7]從黑曲霉(AspergillusnigerNo.5.1)分離出的β-葡萄糖苷酶水解p-NPG和纖維二糖比水解對硝基苯-β-D-吡喃木糖苷、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖和七葉苷更有效,但不能水解結晶纖維素。常軍等[9]從黑曲霉(Aspergillusniger)分離的β-葡萄苷酶對纖維二糖的親和性最大,對麥芽糖、昆布糖幾乎沒有水解作用,說明該酶可水解β-1,4-糖苷鍵,但基本上不水解α-1,4-糖苷鍵和β-1,3-糖苷鍵。Guo等[16]從根毛霉(RhizomucormieheiCAU432)分離的β-葡萄糖苷酶在芳基糖苷中對p-NPG水解性最高,在低聚糖中對昆布二糖水解性更高,可催化各種寡糖中β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,6鍵的裂解,尤其是β-1,3-糖苷鍵并具有較高的轉糖基活性,在一定條件下可將葡萄糖和纖維二糖合成龍膽二糖。Gao等[17]從青霉菌(Pencilliumpiceum)分離的β-葡萄糖苷酶對水楊苷的水解性更高,并且也能水解木糖,是一種具有β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性的新型雙功能糖苷水解酶。每種酶的獨特性質為食品藥品行業特定需求提供更多的選擇性。

1.2 酵母菌和乳酸菌來源

發酵在食品工業中占有非常重要的地位,特別是酵母菌和乳酸菌發酵。很多食品原料中,大部分芳香物質以糖苷前體形式存在,發酵過程中產生的β-葡萄糖苷酶可以將它們釋放為游離的芳香物質,提高產品的感官特性和質量。另一方面,部分霉菌會產生對人身體有害的毒素[21],不能直接加入到食品中。因此,擴大β-葡萄糖苷酶的生產種類也顯得越發重要。表2列舉了部分酵母菌和乳酸菌來源的β-葡萄糖苷酶酶學特性。

表2 部分酵母菌和乳酸菌來源的β-葡萄糖苷酶的性質

釀酒酵母一直以來是葡萄酒發酵的主要微生物,但是越來越多的研究表明,非釀酒酵母如長飽洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)、發酵畢赤酵母(Pichiafermentans)在葡萄汁酒精發酵中發揮重要作用,發酵過程中貢獻更多的芳香類化合物[22-23],使葡萄酒具有更加復雜的口感和香氣,與其產生的β-葡萄糖苷酶有關。已有研究證明馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)是耐熱β-葡萄糖苷酶的有效生產者[24]。K.marxianus菌株常見于各種奶制品,如kefir粒、軟奶酪、奶酪等,已經被分離和鑒定[25-26]。K.marxianus顯示了一些獨特的性質,由于其在各種底物和環境中的耐高溫能力[27]、生長速率快和富含豐富的酶系統的特點,如脂肪酶[28]、蛋白酶[29]、葡聚糖酶[30]、β-葡萄糖苷酶[31]等,是工業過程中理想的微生物原料。不同的來源的K.marxianus,如釀酒酵母和乳酸克魯維酵母[27]是食品安全級的,并且在歐洲已經被列入食品安全生物制劑的權威名單中,可以添加到食品和飼料中[32]。目前,研究表明K.marxianus可以作為益生菌,其效果在臨床研究已經得到認可[33-35],并且發現該菌株具有高β-葡萄糖苷酶的活性[36]。除此之外,食品安全級的乳酸菌也可以分泌出獨特的β-葡萄糖苷酶。Ko等[37]從朝鮮泡菜乳酸菌(LactobacilluskimchiJB301)發酵液中分離出的β-葡萄糖苷酶,可以將虎杖中提取的白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇,產率高達99%,與其他來源的β-葡萄糖苷酶的生產成本高和發酵過程中可能產生的毒性[38-39]弊端相比,LactobacilluskimchiJB301來源的β-葡萄糖苷酶具有高食品安全性特點,在功能性食品中有較高潛在應用價值。

1.3 其它微生物來源

除了上述來源的β-葡萄糖苷酶外,還有一些其他來源的β-葡萄糖苷酶具有其獨特的性質,表3列舉了其他微生物來源的β-葡萄糖苷酶酶學特性。

表3 其他來源的β-葡萄糖苷酶的性質

Hernandez-Guzman等[48]從申克孢子絲菌(SporothrixschenckiiEH-206)發酵液分離的β-葡萄糖苷酶,為由兩個相同亞基構成的二聚體,每個亞基的分子量96.8 kDa,其分子量在197 kDa左右,主要水解纖維二糖、昆布糖、4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷和對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。Asic等[49]所研究的雙孢蘑菇菌(Agaricusbisporus)分泌的β-葡萄糖苷酶催化反應迅速,最大反應速率為833 U/mg,是由兩個分子量大約為46和62 kDa亞基構成的二聚體。變形桿菌(ProteusmirabilisVIT117)[50]分離的β-葡萄糖苷酶表現出極強的耐堿能力,其最適pH為9.0,而從嗜熱微生物中分離出來的β-葡萄糖苷酶顯示出極強的耐熱能力,如Mallek-Fakhfakh等[51]發現的嗜熱真菌(TalaromycesthermopHilus)分泌的β-葡萄糖苷酶在50 ℃下可以穩定34 h,Kong等[52]從嗜熱細菌(ThermotoganapHthopHilaRUK-10)發酵液分離出的重組β-葡萄糖苷酶最適溫度為95 ℃,在75、80、85和90 ℃下的半衰期是分別為84、32、14和3 h。

2 β-葡萄糖苷酶在食品中的應用

β-葡萄糖苷酶可以廣泛的應用于食品工業、保健品、生物能源、農業、醫藥等領域[56],特別是食品工業和保健品領域。果汁、果酒和茶葉中存在多種風味物質且極易揮發,但自身又存在沒有香味且不易揮發的風味前體物質,在β-葡萄糖苷酶作用下裂解糖苷鍵,產生具有濃郁香氣的芳香物質。因此,在食品工業中β-葡萄糖苷酶可以起到增香的作用。在保健品行業中,β-葡萄糖苷酶可將異黃酮糖苷轉化為較高活性的異黃酮苷元,也可以使白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇,具有較高的應用價值。

2.1 果汁中應用

β-葡萄糖苷酶用作食品添加劑[57]作用于水果中的芳香前體物質,利于果汁脫苦和果汁增香。高倩[58]對廉江紅橙果汁添加外源β-葡萄糖苷酶,增加了紅橙果汁中3-蒈烯、安息香醛、環己醇等風味成分,改善了紅橙果汁的風味,起到了增香的作用。王鵬等[59]對蟠桃汁進行β-葡萄糖苷酶酶解處理,蟠桃汁的桃果香、花清香、香甜味顯著增加,不良風味屬性(異味和蒸煮味)顯著降低。張瑤等[60]采用氣相色譜-質譜法對新鮮檸檬汁和β-葡萄糖苷酶酶解處理的檸檬汁的香氣成分進行測定,發現酶解后檸檬汁的香氣種類增加且酶解汁中香氣成分總量增加了11%,不僅釋放出新的香氣物質,還對加工過程中損失的香氣起到彌補作用。此外,β-葡萄糖苷酶也可用于果汁脫苦,可以有效地降低胡柚汁中檸檬苦素、柚皮苷等苦味物質,幾乎不影響果汁中VC等營養成分[61]。

2.2 葡萄酒中應用

在葡萄酒的生產中,β-葡萄糖苷酶能夠顯著增加葡萄酒中的糖苷萜烯類前體物質的水解和單萜類物質的釋放,在葡萄酒香氣形成過程中起著重要作用[62]。Hu等[63]研究發現來自H.uvarum菌株的β-葡萄糖苷酶顯示出對C13-異構體和一些萜類的芳香糖苷的催化特異性,在葡萄酒釀造中增強了葡萄酒中鮮花、甜味、漿果和堅果的香氣特征。另外,添加β-葡萄糖苷酶的葡萄酒不僅使會單萜、酚類和降異戊二烯的濃度顯著增加,且葡萄酒本身的成色物質幾乎不會受到損失[64-65]。Hu等[66]研究發現來自微生物的一種新的β-葡萄糖苷酶顯示出對苯基化合物和C13-異構體的糖苷的水解特異性,并且對釀酒條件表現出很強的耐受性,進一步改善葡萄酒的花香和水果香味特征。

2.3 其他

β-葡萄糖苷酶還可以應用于轉化大豆異黃酮提高保健功能方面[67]。Baú等[68]優化豆漿加工中β-葡萄糖苷異黃酮向糖苷配基的轉化研究,在豆漿加熱中維持大豆黃素和染料木黃酮苷元含量,黃豆黃素和β-葡萄糖苷含量增加,丙二酰葡萄糖苷含量降低。Abdella等[13]將黑曲霉產生的β-葡萄糖苷酶水解大豆粉異黃酮糖苷,用Box-Behnken優化反應影響因素,確定染料木黃酮生產的有效變量,染料木素的濃度增加了11.73倍,發現生物轉化使抗氧化活性增加了四倍。Pyo等[46]將β-葡萄糖苷酶添加到豆奶中,能夠將較低的異黃酮糖苷物質有效轉化為高活性的異黃酮苷元,其中苷元(大豆黃素+染料木黃酮)平均增加7.1倍。

近幾年,β-葡萄糖苷酶在高生理活性的單體的生產方面應用備受關注,如白藜蘆醇和人參稀有皂苷。β-葡萄糖苷酶可以將白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇,目的產物得率高,具有較可觀的工業化應用前景。Gaensly等[69]篩選了308個本地酵母菌株,其中Hanseniasporauvarum生產的β-葡萄糖苷酶在發酵過程中顯示出有效轉化白藜蘆醇葡萄糖苷的能力。馮薇等[70]對虎杖復合酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和虎杖苷專用酶進行白藜蘆醇苷酶解制備白藜蘆醇的工藝,發現β-葡萄糖苷酶的轉化效果最好。Zhou等[15]將虎杖通過β-葡萄糖苷酶的酶促切割而產生白藜蘆醇,幾乎所有虎杖中的白藜蘆醇苷都轉化為白藜蘆醇。

β-葡萄糖苷酶可以有效的水解人參皂苷,將大量的常見皂苷轉化為稀有人參皂苷,是大量獲得稀有人參皂苷的新途徑[71]。Siddiqi等[47]利用β-葡萄糖苷酶的轉移葡萄糖基的作用,可以將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷Rg3。邵巍等[55]研究利用β-葡萄糖苷酶將人參皂苷Rb1的C-21位兩個-GLc鍵水解,進而轉化為稀有人參皂苷Rg3。

3 展望

微生物來源的β-葡萄糖苷酶資源的挖掘和酶學特性的分析已經取得了長足的進展,特別是在食品微生物來源的β-葡萄糖苷酶的特性和應用,越來越受到食品加工領域的關注,但仍存在一些問題亟待解決。第一:雖然關于微生物β-葡萄糖苷酶研究報道較多,但實際市售的β-葡萄糖苷酶的提取來源大多還是來源于杏仁,由于原料有限,其價格相對較高,要應用于大規模的食品工業,就單從成本考慮限制其應用。這說明微生物來源的β-葡萄糖苷酶雖然有巨大的開發價值,但是由于其產酶量少,活性低,大大限制了研究成果的轉化。進一步結合基因工程等現代生物技術,挖掘高活性β-葡萄糖苷酶微生物和優化價格低廉的生產工藝將是亟待解決的問題。第二:與其他來源的酶相比,β-葡萄糖苷酶底物特異性較廣泛,而在大多數研究中發現其最適底物基本為p-NPG,對其他類型的β-葡萄糖苷鍵的底物親和性相對較低,而p-NPG不是食品成分。因此,尋找對自然底物更強特異性的β-葡萄糖苷酶,挖掘潛在的生物學功能是目前的重要挑戰。第三:β-葡萄糖苷酶在食品風味改良方面的研究已經普遍得到認可,但是目前應用領域多限制在葡萄酒和茶葉的增香方面。與人工添加的芳香物質相比,酶解產生的風味物質更具有安全性,能滿足消費者對食品原汁原味的需求。拓寬β-葡萄糖苷酶的應用領域將促進β-葡萄糖苷酶的創新和研究發展,在食品工業中極具應用價值,為食品工業帶來新的發展契機。