響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合菌種發(fā)酵葡萄玫瑰花飲品及其抗氧化能力的測定

王舸楠,劉維兵,王雪薇,全 莉,尹麗萍,武 運,*,薛 潔

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊,830052) 2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015)

玫瑰(Rosarugosa)是一種集藥用、食用、美化、綠化于一體的木本植物,含有豐富的酚類和萜烯類物質(zhì),具有極高的食用價值和藥用價值[1]。葡萄(Vitisvinifera)是世界上廣泛種植的水果之一,具有多種生物學(xué)功能,如抗菌、抗癌、抗氧化就、抗炎的作用,因其含有豐富的多酚和黃酮類化合物而具有天然的抗氧化能力而深受人們喜愛[2]。目前,人們對玫瑰和葡萄發(fā)酵主要是制備酒類或濃縮果汁類飲品。近些年隨著發(fā)酵飲品的興起,越來越多的食品企業(yè)開始使用不同的原材料制備發(fā)酵飲品[3]。其在保留原材料營養(yǎng)物質(zhì)的同時又增加了微生物通過發(fā)酵所產(chǎn)生的特有生物活性物[4]。目前發(fā)酵飲品種類繁多,由不同原材料和益生菌發(fā)酵形成的發(fā)酵液具有不同的風(fēng)味和抗氧化能力。李凡等[5]通過篩選不同的酵母菌,設(shè)置不同時間、溫度通過發(fā)酵白首烏從而得到白首烏酵素的最優(yōu)SOD活力。劉進杰等[6]通過優(yōu)化葡萄皮渣發(fā)酵工藝從而提高了發(fā)酵液的抗氧化活性。目前,發(fā)酵飲品正在朝著通過篩選發(fā)酵菌種,監(jiān)控發(fā)酵體系,合理的抑制雜菌生長。提高飲品安全性的方向發(fā)展。

本文選用可應(yīng)用于制麥過程中的白地霉[7]與乳酸菌對玫瑰花與葡萄汁進行發(fā)酵制備飲品。白地霉(Geotrichumcandidum)最初歸屬于霉菌,1983年Barnett等在其編寫的《Yeasts:Characteristics and Identification》一書中將白地霉列入酵母菌類群中,研究表明白地霉在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生脂類和β-苯乙醇的香氣物質(zhì)且具有食用安全性[8]。本文首次使用白地霉和乳酸菌對玫瑰與葡萄發(fā)酵液進行發(fā)酵,以達到產(chǎn)酸和提高感官評分的目的,選取發(fā)酵時間、溫度與不同菌種的添加量做為單因素,以總多酚含量為響應(yīng)值通過響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄玫瑰花發(fā)酵工藝,測定發(fā)酵飲品的SOD活力、花青素含量、DPPH清除能力以評估發(fā)酵飲品的體外抗氧化能力,預(yù)制備一款口感優(yōu)良具有抗氧化能力的飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用玫瑰、品種豐花 湖北棗陽倪氏國際玫瑰研究中心;釀酒葡萄 品種赤霞珠,采自新疆北疆產(chǎn)區(qū);白地霉(GC)、植物乳桿菌(LP) 由實驗室提供;總多酚試劑盒、花青素試劑盒 西班牙Biosystem股份公司;總SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所。

SHIMADZU UV-1780 紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司;10、50、100 mL容量瓶 天津市天玻玻璃儀器有限公司;超純水機 美國賽默飛世爾科技公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;冷凍離心機 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司;精密天平 瑞士梅特勒-托利多集團;恒溫水浴鍋 北京科偉有限公司;Y 15葡萄酒自動分析儀 西班牙Biosystem股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品制備工藝

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2 操作要點 葡萄汁以葡萄經(jīng)壓榨過濾后70 ℃保溫5 min殺菌,于4 ℃環(huán)境下保存[9];玫瑰干花去花托后,將花瓣剝離放入500 mL錐形瓶中,加入葡萄汁后補無菌水至所需刻度接種進行發(fā)酵,后擴培,發(fā)酵結(jié)束后過濾并于7500 r/min條件下離心。

發(fā)酵菌種由斜面取一環(huán)于10 mL液體培養(yǎng)基(白地霉于YPD培養(yǎng)基,乳酸菌于MRS培養(yǎng)基)中活化,為不影響發(fā)酵飲品的感官評分,菌種以10%蘋果濃縮汁無菌水溶液作為培養(yǎng)基進行10倍擴培。菌種白地霉于28 ℃條件下培養(yǎng)31 h,乳酸菌在36 ℃條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.2 葡萄與玫瑰花的配比 為模擬葡萄玫瑰花發(fā)酵液的條件,首先加入1%的玫瑰花以作為初始玫瑰添加量,加入10%、20%、30%、40%、50%的葡萄汁,后補無菌水至300 mL,測定葡萄玫瑰花混合液的總多酚,感官評分確定葡萄汁的添加量;葡萄汁添加量為上面實驗中得出的適宜條件,加入0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.5%的玫瑰花,通過總多酚、感官評定評分確定玫瑰花的添加量。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同復(fù)合菌種添加比對發(fā)酵液總酸與總多酚含量的影響 在錐形瓶中準(zhǔn)確稱取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,補水至300 mL,在發(fā)酵溫度為33 ℃,發(fā)酵時間為48 h條件下,菌種以擴培液的形式以發(fā)酵液總量的百分比加入發(fā)酵液中,復(fù)合菌種的總接種量為發(fā)酵液的10%,考察白地霉、乳酸菌的添加量分別占總添加量的比為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7的情況下對總多酚、總酸含量的影響。

1.2.3.2 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵液總酸與總多酚含量的影響 在錐形瓶中準(zhǔn)確稱取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,補水至300 mL,在白地霉、乳酸菌添加比為5∶5,發(fā)酵時間為48 h下考察發(fā)酵溫度為23、28、33、38、43 ℃ 情況下對總多酚、總酸含量的影響。

1.2.3.3 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵液總酸與總多酚含量的影響 在錐形瓶中準(zhǔn)確稱取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,補水至300 mL,在白地霉、乳酸菌添加比為5∶5,發(fā)酵溫度為33 ℃條件下考察發(fā)酵時間為12、24、36、48、60 h 情況下對總多酚、總酸含量的影響。

1.2.3.4 不同發(fā)酵初始pH對發(fā)酵液總酸與總多酚含量的影響 在錐形瓶中準(zhǔn)確稱取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,補水至300 mL,在白地霉、乳酸菌添加比為5∶5,發(fā)酵溫度為33 ℃條件,發(fā)酵時間48 h條件下。通過添加3%碳酸氫鈉溶液調(diào)整發(fā)酵液的初始pH考察初始pH為4、4.5、5、5.5、6的條件下對總多酚、總酸含量的影響,自然條件下發(fā)酵液初始pH為3.93。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化白地霉發(fā)酵工藝 通過單因素實驗,選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、菌種添加比三個因素,使用 Design Expert 8.0.6 軟件,設(shè)計3因素3水平Box-Behnken中心組合實驗,響應(yīng)面因素及水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品感官評價 結(jié)合張水華[10]食品感官品鑒,從色澤、氣味、滋味和形態(tài)四個方面進行綜合評定,感官評定表見表2。由5個相關(guān)專業(yè)人士進行品鑒。樣品隨即編碼,隨機發(fā)放,按照感官評定表標(biāo)準(zhǔn)進行評估,結(jié)果取平均值。

表2 葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品感官評分表Table 2 Grape-rose fermentative beverage sensory score

1.2.6 總多酚含量的測定 使用Y 15葡萄酒自動分析儀,總多酚試劑盒法進行測定,其中試劑A為2×20 mL福林酚溶液、試劑B為2×20 mL碳酸鈉、試劑S為標(biāo)準(zhǔn)品1×5 mL,波長670 nm,分析模型為雙試劑終點法,試劑與標(biāo)準(zhǔn)品可直接上機檢測;檢測步驟,將發(fā)酵液離心后取1 mL加入空白皿中。將空白皿放入托盤,置于Y15全自動葡萄酒分析儀中進行檢測[11-12]。

1.2.7 總酸含量的測定 參照國標(biāo)GB/T 15038-2006,利用酸堿中和原理,用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液直接滴定樣品中的有機酸,以pH為8.2作為電位滴定終點,根據(jù)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,計算試樣的總酸含量[13]。

1.2.8 葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品體外抗氧化能力測定

1.2.8.1 SOD活力測定 按照SOD試劑盒說明書配制試劑,測試樣品需要稀釋10倍,測定時吸取1 mL樣液,按照試劑盒要求依次加入試劑,于波長550 nm下測定吸光度值。

式中,A0:對照OD值,A1:測定OD值,B:反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù),C:樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

1.2.8.2 花青素含量的測定 使用Y 15葡萄酒自動分析儀,花青素試劑盒進行發(fā)酵飲品中花青素含量的測定,其中,試劑A為鹵代緩沖溶液,分析模型為單試劑終點法,波長520 nm,試劑與標(biāo)準(zhǔn)品可直接使用,檢測步驟,將發(fā)酵液離心后取1 mL加入空白皿中。將空白皿放入托盤,置于Y 15全自動葡萄酒分析儀中進行上機檢測[14-15]。

1.2.8.3 DPPH自由基清除能力 使用DPPH法研究葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品中的抗氧化能力,取0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL Trolox母液分別于10 mL容量瓶中并稀釋成不同濃度,取0.1 mL各濃度Trolox溶液加入25 mg/L的3.9 mL DPPH甲醇溶液中,避光反應(yīng)20 min,在517 nm波長下測定吸光度,以Trolox濃度為Y軸,吸光度為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用同樣的方法測定樣品在517 nm處的吸光度,結(jié)果以Trolox的當(dāng)量值TEAL表示,單位為 μmol/L。每個樣品處理重復(fù)3次[16],標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=788.59x+156.66,R2=0.995。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)三次,使用Design-expert V8.0.6 進行響應(yīng)面設(shè)計及統(tǒng)計分析,采用Origin 9.0進行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花與葡萄汁添加量對發(fā)酵液中總多酚與感官評分的影響

葡萄汁添加量由圖1所示,總多酚含量隨著葡萄汁添加量的增多而升高,當(dāng)添加量為50%時總多酚含量最高,達到9.92×102mg/L。隨著葡萄添加量的升高,感官評分同時升高,當(dāng)葡萄添加量達到30%時分數(shù)最高,達到92分。之后開始下降,這是由于隨著葡萄添加量升高,葡萄所帶來的甜膩程度開始升高,從而影響感官評分。玫瑰花添加量由圖2所示,總多酚含量隨著玫瑰花添加量的增多而升高,當(dāng)玫瑰花添加量為1.5%時總多酚含量最高,達到10.92×102mg/L。隨著玫瑰花添加量的增多,感官評分先升后降,其中,玫瑰花在添加量為0.75%時所得感官評分最高為91分。之后開始下降,這可能是由于植物總多酚含量的偏高會帶來苦澀口感[17],隨著玫瑰花添加量的增多,發(fā)酵液總多酚含量升高,發(fā)酵液苦澀口感增重,從而影響感官評分,最終確定玫瑰花添加量為0.75%,葡萄汁添加量為30%。

圖1 不同葡萄汁添加量對總多酚與感官評分的影響

圖2 不同玫瑰花添加量對總多酚與感官評分的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 不同復(fù)合菌種添加比對發(fā)酵液總多酚與總酸含量的影響 結(jié)果如圖3所示,在發(fā)酵過程中,隨著復(fù)合菌種體系中乳酸菌添加量增高,總酸含量開始升高,當(dāng)復(fù)合菌種添加比為3∶7時總酸含量最高,達到3.73 g/L。總多酚含量隨著復(fù)合菌種體系中乳酸菌添加量的增高而降低。當(dāng)復(fù)合菌種添加比為3∶7時總多酚含量最低,為9.49 mg/L,當(dāng)添加比為7∶3時總多酚含量最高,達到9.83 mg/L。這可能是因為乳酸菌在發(fā)酵過程中總酸含量升高,降低溶液pH,從而在一定程度上影響酶的活性,微生物的細胞膜所帶電荷會有所改變,因此改變了細胞膜的透性,從而降低了復(fù)合菌種體系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝物的排泄[18],考慮到乳酸菌添加量對發(fā)酵液酸度的影響,最終選取6∶4、5∶5、4∶6作為響應(yīng)面的三水平。

圖3 復(fù)合菌種配比對總多酚與總酸含量的影響

2.2.2 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵液總多酚與總酸含量的影響 結(jié)果如圖4所示,總酸含量隨著發(fā)酵時間的增長而升高,在發(fā)酵60 h時達到3.53 g/L。總多酚含量同樣隨著發(fā)酵時間的增長而升高,在發(fā)酵第60 h時達到9.83×102mg/L,其中,在發(fā)酵12～48 h,總多酚含量增長較快,增長了0.67×102mg/L,在發(fā)酵48 h后總多酚含量增長緩慢。這可能是由于發(fā)酵開始時總多酚從原材料中的溶出率增大,發(fā)酵48 h后,其溶出速率開始緩慢下降的原因。根據(jù)單因素試驗最終選取36、48、60 h作為響應(yīng)面三水平。

圖4 不同發(fā)酵時間對總多酚與總酸含量的影響

2.2.3 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵液總多酚與總酸含量的影響 結(jié)果如圖5所示,總酸主要受到乳酸菌發(fā)酵的影響,其中,在發(fā)酵溫度為38 ℃時,總酸含量最高,而低于38 ℃時,因未達到乳酸菌最適發(fā)酵溫度,發(fā)酵液中總酸含量有所降低。總多酚含量隨著發(fā)酵溫度的升高而升高,在發(fā)酵溫度為33 ℃最高,達到9.84×102mg/L。這可能是由于在發(fā)酵液中,分子的滲透、擴散、溶解速率會隨著溫度升高而加快。高溫可在一定程度上破壞細胞壁的完整性,使活性物質(zhì)易從果肉細胞轉(zhuǎn)移到溶劑中[19]。根據(jù)單因素試驗最終選取28、33、38 ℃作為響應(yīng)面三水平。

圖5 不同發(fā)酵溫度對總多酚與總酸含量的影響

2.2.4 不同初始pH對發(fā)酵液總多酚與總酸含量的影響 結(jié)果由圖6所示,總酸含量隨著初始pH升高而升高,初始pH為6時總酸含量最高,達到 3.9 g/L;其中,初始pH為5～6時,總酸的增長率最高。這可是由于該初始pH范圍適合該乳酸菌的生長。總多酚含量隨著初始pH的升高先升后降,其中,初始pH在4～4.5范圍內(nèi)時，總多酚含量小幅度增長,達到9.76×102mg/L。初始pH在5～6范圍內(nèi)時,發(fā)酵液中總多酚含量下降,當(dāng)pH為6時總多酚含量最低,為9.47×102mg/L。由于發(fā)酵液初始pH為4,pH的升高對總多酚升高無明顯意義。因此,以發(fā)酵液初始pH作為響應(yīng)面中的固定pH。

圖6 不同初始pH對總多酚與總酸的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品工藝

發(fā)酵液在發(fā)酵過程中,總多酚含量明顯增加,且為了凸顯發(fā)酵飲品的抗氧化能力,選擇總多酚作為響應(yīng)值,以單因素實驗為基礎(chǔ),通過Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理,設(shè)計以復(fù)合菌種添加比(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)為基礎(chǔ)的3因素3水平共17組響應(yīng)面分析實驗。實驗因素和水平見表1,中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果見表3,方差分析見表4。響應(yīng)面分析圖見圖7。

表3 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design

表4 多元回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of multiple regression equation

通過Design-Expert V 8.0.6軟件對分析結(jié)果進行多元回歸擬合,得到方程為:

Y=9.86-0.24A-0.1B+0.038C-0.13AB-0.063AC-0.072BC-0.12A2-0.33B2-0.26C2

由表4可知,一次項與二次項均對發(fā)酵液總多酚含量影響表現(xiàn)出極顯著水平,交互項AB、AC、BC對總多酚含量影響表現(xiàn)均為顯著(p<0.05)。且根據(jù)顯著性與F值大小可知,影響總多酚含量因素的主次順序為：添加比(A)>發(fā)酵溫度(B)>發(fā)酵時間(C)。

多酚類物質(zhì)包括黃酮化合物與花色苷等物質(zhì),因其具有較強的自由基清除能力,也可作為發(fā)酵飲品抗氧化能力的重要指標(biāo)[20]。為了反映各因素及其交互作用對總多酚含量的影響,對回歸方程繪制三維響應(yīng)面圖及其等高線,結(jié)果如圖7所示,菌種添加比和發(fā)酵溫度的交互作用顯著,當(dāng)復(fù)合菌種配比中白地霉添加量增加時,發(fā)酵液總多酚含量升高,且發(fā)酵溫度也與單因素結(jié)果相符。菌種添加比與發(fā)酵時間交互作用顯著,由圖可看出隨著白地霉添加量增加、發(fā)酵時間增長,總多酚含量升高。發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間交互作用顯著,隨著發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的增加,總多酚含量呈極大值點。

圖7 各因素交互作用對總多酚含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

經(jīng)過響應(yīng)面模型預(yù)測,葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品中總多酚含量最佳工藝是在葡萄汁添加量為30%、玫瑰花添加量為0.75%的條件下,白地霉與乳酸菌的添加比為5.5∶4.5,發(fā)酵溫度為32.6 ℃,發(fā)酵時間為48.2 h,在該最佳工藝條件下,葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品中的總多酚含量應(yīng)為9.96×102mg/L,對工藝進行優(yōu)化后,選取添加比為5.5∶4.5,發(fā)酵溫度為33 ℃,發(fā)酵時間為48 h,進行三次平行實驗且取平均值,在此條件下葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品的總多酚含量測定值為9.92×102mg/L,與預(yù)測值的相對誤差為0.4%,說明該工藝可行,具備一定的應(yīng)用價值。

2.4 葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品動態(tài)感官評定

按照響應(yīng)面優(yōu)化工藝進行葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品的發(fā)酵實驗,總發(fā)酵時間為60 h,按照每12 h取樣并離心進行感官評定,結(jié)果由圖8所示,第12 h由于菌種還未起酵,葡萄汁所帶來的甜膩口感在很大程度上影響了感官評定評分,隨著發(fā)酵的進行,發(fā)酵液內(nèi)的酸甜口感逐漸趨于平衡,當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，感官評分最高為92,當(dāng)發(fā)酵時間為60 h時,由于乳酸菌發(fā)酵代謝乳酸增多消耗了過多的糖,導(dǎo)致發(fā)酵液口感偏酸,影響感官評定評分。

圖8 葡萄玫瑰花發(fā)酵液動態(tài)感官評定評分

2.5 葡萄玫瑰花發(fā)酵飲品體外抗氧化能力測定

2.5.1 發(fā)酵過程中SOD活力的變化 每12 h對葡萄玫瑰花發(fā)酵液取樣離心進行測定,結(jié)果由圖9所示,隨著發(fā)酵時間的增長,葡萄玫瑰花發(fā)酵液的SOD活力升高,其中0～24 h增長速率較快,SOD活力增長了4.78×103U/L,在復(fù)合菌種發(fā)酵第24 h后,SOD活力趨于穩(wěn)定,當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時SOD活力達到5.31×103U/L。

圖9 葡萄玫瑰花發(fā)酵過程中SOD活力的變化

2.5.2 發(fā)酵過程中花青素含量的變化 實驗結(jié)果如圖10所示,花青素是一類優(yōu)良的天然抗氧化劑,其抗氧化能力是維生素E的50倍,且比維生素C高20倍[20],葡萄玫瑰花發(fā)酵液在發(fā)酵過程中,花青素含量基本維持在28 mg/L左右,在發(fā)酵后與發(fā)酵起始時對比,發(fā)酵過程中花青素含量升高了將近2 mg/L,但含量維持于穩(wěn)定狀態(tài),因此復(fù)合菌種發(fā)酵過程沒有影響到花青素含量,使其依然保持了葡萄和玫瑰花富含的天然花青素含量。

圖10 葡萄玫瑰花發(fā)酵過程中花青素含量的變化

2.5.3 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力 結(jié)果如圖11所示,發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力隨著發(fā)酵時間的增長而升高,在發(fā)酵第48 h時，達到857 μmol/L。在發(fā)酵48 h內(nèi)共增長了357 μmol/L。

圖11 葡萄玫瑰花發(fā)酵過程中DPPH自由基清除力的變化

3 結(jié)論

在葡萄汁添加量為30%、玫瑰花添加量為0.75%的條件下,選取復(fù)合菌種白地霉和乳酸菌的添加量為5.5∶4.5,發(fā)酵溫度33 ℃,發(fā)酵時間48 h進行發(fā)酵,其總多酚含量為9.92×102mg/L,且在該條件下感官評分為92。之后,對發(fā)酵飲品進行體外抗氧化能力測定,結(jié)果表明,在復(fù)合菌種發(fā)酵作用下,SOD活力達到5.31×103U/L,且發(fā)酵過程沒有影響葡萄與玫瑰花中花青素含量的變化,DPPH自由基清除能力也由500 μmol/L升高至857 μmol/L。

本文首次使用白地霉與乳酸菌復(fù)合發(fā)酵葡萄與玫瑰花制備發(fā)酵飲品。根據(jù)實驗結(jié)果表明,其在保留了原材料抗氧化能力同時,又通過復(fù)合菌種發(fā)酵增加了酸甜的口感,并同時提高了抗氧化能力,增加了原材料的附加值,有利于葡萄玫瑰花產(chǎn)業(yè)發(fā)展。