以IL-1β為基礎的腹腔不同免疫水平對直腸癌術后腹腔微轉移灶轉歸的作用

魯兵 張振宇 倪荔 嚴東羿 朱哲 高瑋 袁彪 楊颻 傅傳剛

直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，遠處轉移和復發是直腸癌患者面臨的主要問題。但在局部微環境條件合適時，游離出來的癌癥細胞能夠與腹膜間質細胞相粘附促進腫瘤轉移。在影響癌細胞粘附的眾多因素之中，白介素1β（IL-1β）與腫瘤的發展關系密切。既往研究顯示IL-1β參與了腫瘤侵襲轉移等多種過程。本研究以體外原代培養人腹膜間皮細胞為研究對象，采用流式細胞術檢測不同濃度IL-1β 和IL-1β抗體對腹膜間皮細胞與直腸癌細胞黏附的影響；從而明確IL-1β在直腸癌腹膜轉移中的作用。

材料與方法

一、材料

人直腸癌細胞株HT-29購自上海中科院細胞庫。

二、實驗方法

1.人腹膜間皮細胞原代培養：

（1）無菌條件下，將臨床手術（臨床樣本來自于在同濟大學附屬東方醫院胃腸外科接受擇期手術治療、無腹腔炎癥、種植轉移的直腸癌患者，術前均簽署知情同意）獲得的人網膜樣本剪碎，用預冷并含有雙抗的PBS清洗3遍。（2）用0.1%Ⅰ型膠原酶在37 ℃恒溫條件下震蕩消化2 h。（3）1000 rpm 離心10 min，吸去上層脂肪組織及油脂，PBS重懸沉淀。（4）200目篩網進行過濾，并再次1000 rpm離心5 min，棄上清。（5）沉淀中加入紅細胞裂解液裂解5 min。（6）PBS沖洗兩遍，1000 rpm離心5 min棄上清。（7）沉淀中加入含10%FBS和1%雙抗的1640培養基重懸，以5×105/孔的密度接種至6孔板中，6孔板提前用多聚賴氨酸包被，于37 ℃ 5%CO2培養箱中進行培養。（8）每3天進行換液，細胞長至90%融合時1:3進行傳代，取第2、3代細胞進行試驗。

2.人腹膜間皮細胞免疫熒光染色鑒定：

細胞爬片的制作。

（1）24孔板中放入Fisher brand蓋玻片，加入250 uL的多聚賴氨酸，37 ℃ 10 min；（2）棄多聚賴氨酸，超凈臺UV消毒2～3 h。（使用前用ddH2O或PBS洗兩遍）；（3）細胞用胰酶消化后離心（懸浮細胞可不用胰酶消化），用完全培養基重懸，并細胞計數；（4）取適量細胞懸液分別滴到圓片上，30 min后，在24孔板中補加完全培養基至500 uL，放入培養箱培養6 h以上；（5）取出24孔板，用PBS漂洗2遍；（6）4%多聚甲醛處理（室溫）10 min；（7）PBS漂洗，5 min，3遍；（8）0.5%Triton X-100 處理（室溫）5 min；（9）PBS漂洗，5 min，3遍；（10）封閉（室溫）1 h；（11）孵育一抗4 ℃孵育過夜；（12）PBS漂洗，5 min，3遍；（13）孵育熒光二抗，RT孵育 1～2 h；（14）PBS漂洗，5 min，3遍；（15）DAPI，5 min；（16）PBS漂洗，5 min，3遍；（17）封片劑封片（可用帶抗淬滅劑的封片劑封片，片子保存時間更久），鏡下觀察在熒光顯微鏡下拍照。

3.直腸癌細胞培養：

細胞培養與凍存：使用含10% FBS的RPMI 1640培養基，在常規條件下培養HT-29細胞（37 ℃、5%CO2），每3～4天胰酶消化后傳代培養。取對數期生長細胞胰酶消化后，使用10%DMSO 以1×107/mL細胞濃度分裝，液氮凍存。

4. IL-1β/anti-IL-1β與人腹膜間皮細胞共孵育：

本實驗設置為2組：（1）單藥組：使用0、1、5、10、15 ng/mL濃度IL-1β與對數期生長腹膜間皮細胞在37 ℃、5%CO2培養箱中共孵育6h；（2）雙藥組：在經0、1、5、10 ng/mL IL-1β 處理過的間皮細胞中，分別加入終濃度為0、0.1、0.5、1.0 μg/ mL 的 anti-IL-1β 以拮抗 IL-1β 的作用。其中以0 ng/mL IL-1β/0 μg/mL anti-IL-1β處理組為對照組。

5. DiI 標記HT-29細胞：

取HT-29細胞與10 μg/mL DiI染液在37 ℃、5%CO2條件下共孵育20 min，并使用流式細胞儀檢測熒光標記情況。

6. FACS檢測細胞黏附率：

接種間皮細胞于24孔培養板，待細胞融合成單層，細胞數約為4×104/孔時開始實驗。首先使用IL-1β/anti-IL-1β按上述方法預處理間皮細胞。然后將DiI標記好的過量HT-29細胞接種接種于24孔板，與間皮細胞在37 ℃、5%CO2條件下共孵育。4 h后D-Hanks液沖洗3次，并使用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集細胞，800 r/min離心5 min，細胞沉淀使用1 mL PBS重懸浮，各取6個復孔用于實驗。以565 nm為發射波長，549 nm為激發波長，檢測10 000個樣本。細胞黏附率（R）計算公式為：R=R2/（R1＋R2），其中R1通道代表未標記的間皮細胞，R2通道代表DiI標記的HT-29細胞。

三、統計分析

所有統計分析使用SPSS 19.0完成。各組黏附率以均數±標準差（x±s）表示，組間細胞黏附率的比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析；本研究以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、人腹膜間皮細胞原代培養和鑒定

原代培養的人腹膜間皮細胞在4天左右可半量換液，大約2周左右可以傳代，具體細胞狀態見圖1。免疫熒光染色證明原代培養細胞中的Vimentin表達陽性；人腹膜間皮細胞標志物為Vimentin，經IF鑒定波形蛋白（Vimentin）陽性率為85%，人von Willebrand（VWF）因子表達陰性；說明分離出來的細胞均為腹膜間皮細胞（圖2）。

二、流式細胞儀檢測細胞黏附率

流式細胞術檢測結果可知（圖3、圖4），隨著IL-1β濃度的增加，細胞粘附率依次增加，當加入抗體IL-1β后，隨著抗體濃度的增加，人腹膜間質內皮細胞與癌細胞粘附率呈現下降趨勢。且5 ng/mL的IL-1β含量時，細胞粘附率最高，顯著高于其他組（P＜0.05）；10ng/mL的IL-1β含量時粘附率高于其他組，僅低于5 ng/mL的IL-1β組；加入抗體IL-1β后所有組別的粘附率趨勢與不加前一致，但是所有組別的粘附率均降低，1 ng/mL IL-1β組＋0.1 μg/mL抗體組和5 ng/mL IL-1β組＋0.5 μg/mL抗體組的細胞粘附率最高，陰性對照組細胞粘附率最低，顯著低于其他組（P＜0.05）。

圖1 人腹膜間皮細胞原代培養照片。1A：第1天，1B：第3天，1C：第5天，1D：第9天，1E：P1代，1F：P2代（×100倍）

討 論

腫瘤轉移涉及多基因、多機制和多步驟調控，轉移性細胞與宿主相互作用并發生不同形式的轉歸，如凋亡、休眠和侵襲增殖，從而影響轉移的發生和發展。腹腔殘余癌細胞與間皮細胞等局部微環境相互作用是腹膜轉移的起始步驟之一，然而轉移細胞形成臨床轉移效率極低［1-2］，這與細胞粘附、侵襲能力、機體免疫監視及腫瘤細胞休眠等多種因素調密切相關［3-4］。

不恰當的手術操作被認為能增加直腸癌細胞腹膜播散風險，脫落入腹腔的癌細胞與腹膜間皮細胞之間的黏附則是決定腹腔轉移灶形成的首要環節。在這一過程中體液免疫和多種細胞因子，對于游離癌細胞的轉歸起到重要作用。白介素是由多種細胞產生并作用于多種細胞的一類細胞因子，在細胞信息傳遞、免疫調節、炎癥反應［5-7］及腫瘤生長和侵襲中起到廣泛作用［8-10］。本研究將腹膜間質內皮細胞和癌細胞共培養并用不同的濃度IL-1β進行處理，結果提示隨著IL-1β濃度增高，細胞的粘附率顯著增加；當同時加入不同含量anti-IL-1β抗體，細胞粘附率再次被明顯抑制。提示IL-1β能夠促進直腸癌HT-29與腹膜間皮細胞粘附，從而促進直腸癌腹膜轉移。

圖2 原代培養人腹膜間皮細胞鑒定結果。2A：DAPI染色，2B：Vimentin染色，2C：Merge，2D：DAPI染色，2E：VWF染色，2F：Merge （×100倍）

既往研究發現，在大腸癌患者外周血中IL-1β水平顯著高于健康人群［9-10］，腹部手術后IL-1β表達水平普遍升高，可用于評價手術創傷對患者免疫功能的影響［11］。Cheong 等［12］研究發現 IL-1β 可參與手術創傷后腹膜細胞外基質的重建，是發生腹腔內粘連的原因之一。本研究結果顯示腹膜間皮細胞經IL-1β處理后，隨著IL-1β濃度增加，其與癌細胞的黏附率逐漸升高，并且這種作用可被其抑制劑抗IL-1β所阻斷。近期的研究顯示，IL-1β能夠通過作用于表達IL-1Ra的人腹膜間皮細胞上調其ICAM-1分子表達水平，從而促進癌細胞與腹膜間皮細胞的粘附［13-15］。本研究也顯示IL-1β增強癌細胞與腹膜間皮細胞黏附的效應能夠被anti-IL-1β所特異性阻斷。

目前結直腸癌的發病率呈逐年遞增趨勢，其發病率已位居全球惡性腫瘤的第3位、中國第4位［16-17］。在結直腸癌根治術后，即便是早期結直腸癌，仍有超過30～40%患者死于術后腫瘤局部復發和轉移［18-20］。以微創為顯著特征的腹腔鏡結直腸手術開創結直腸癌治療新領域，推動了外科治療的快速發展。既往大量研究證明［21-25］，腹腔鏡手術相較于傳統開腹手術，術中出血量少、術后恢復快、并發癥少，臨床效果優于傳統手術組［26］，對患者免疫功能的影響更小［27］。免疫功能的變化可能對患者腹腔微轉移轉歸產生影響，對于腹腔鏡手術是否造成結直腸癌尤其是局部晚期結直腸癌腹膜播散轉移風險增加，以及能否行腹腔鏡根治術目前爭議較大。其原因很多，除腹腔鏡手術中CO2氣腹對癌細胞侵襲轉移的微環境的影響外，目前熱點還多集中于腹腔鏡手術對于患者免疫機能的影響，以及對于微轉移灶轉歸的影響［28］。研究已經證實腹腔鏡手術相較于傳統手術，術后IL-1β升高水平更低，對患者免疫功能影響更?。?9］，本研究證實隨著IL-1β濃度增高，直腸癌細胞與間皮細胞粘附率顯著增加；當加入不同含量anti-IL-1β抗體，細胞粘附率被明顯抑制。以上結果均提示IL-1β能夠促進直腸癌HT-29與腹膜間皮細胞粘附，從而促進直腸癌腹膜轉移；腹腔鏡手術因其微創，引起的IL-1β水平升高顯著低于開腹手術，故可以減少由IL-1β介導的直腸癌腹膜轉移。

圖3 各實驗組流式細胞檢測結果。3A：陰性對照組，3B：0 ng/mL IL-1β組，3C：1 ng/mL IL-1β組，3D：5 ng/mL IL-1β組，3E：10 ng/mL IL-1β組，3F：0 ng/mL IL-1β＋ 0 μg/mL抗體組，3G：1 ng/mL IL-1β＋0.1 μg/mL抗體組，3H：5 ng/mL IL-1β ＋ 0.5 μg/mL 抗體組，3I：5 ng/mL IL-1β ＋ 1 μg/mL 抗體組

圖4 各實驗組細胞的粘附率結果