草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防效及安全性評價

賈小霞 劉 石 齊恩芳 呂和平 文國宏李 掌 馬 勝 曲亞英

(1 甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所/甘肅省馬鈴薯種質資源創新工程實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2 農業部西北旱作馬鈴薯科學觀測實驗站，甘肅 渭源 748201)

隨著馬鈴薯主糧化戰略的推進，馬鈴薯種植面積日益擴大。然而，隨著中國產業結構的調整，大量農村青壯年勞動力向非農產業轉移，傳統的人工鋤草越來越不現實，草害問題越來越突出，嚴重影響了馬鈴薯的產量和品質[1-2]，化學除草已成為現代農業中不可缺少的管理手段和我國廣大農業生產者所依賴的除草方式[3-4]。研究發現實踐中化學除草存在一定的不足，一方面，殺草譜廣、活性高的除草劑大多缺乏選擇性，在殺滅雜草的同時可能對本田作物產生藥害，影響作物品質及產量[5-7]；另一方面，選擇性強的除草劑只能防治少數雜草，不能兼治田間多種雜草，達不到理想的防治效果[8]。通過轉基因技術使農作物獲得對廣譜滅生性除草劑的抗性，不僅可以克服除草劑的選擇性，提高除草效果，降低除草成本，而且可以增加作物的安全性[9]。因此，為了更有效地發揮除草劑對雜草的防除作用及解決除草劑使用過程中出現的負面問題，耐廣譜滅生性除草劑轉基因作物的推廣種植可能成為我國農業生產的必然選擇和確保我國糧食安全的戰略需求[10]。

草銨膦是繼草甘膦之后又一性能優良的滅生性除草劑，其在土壤中的半衰期為3～7 d[11]，具有活性高、毒性低、易分解、殘留低和環境兼容性好等特點，可防治對草甘膦和百草枯有抗性的頑固雜草[12]，且長期使用的環境安全也得到了肯定[13-14]，具有良好的應用前景。草銨膦的抗性基因Bar來自土壤吸水鏈霉菌，它編碼膦絲菌素乙酰轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase，PAT)，PAT使膦絲菌素(phosphinothricin，PPT)的自由氨基乙酰化從而對PPT解毒，使之不能抑制谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的活性[15]。目前，馬鈴薯轉化Bar基因獲得草銨膦抗性的研究已有相關報道[16-18]，但多是將Bar基因作為篩選標記基因用于篩選陽性植株，或作為目的基因進行轉化，且僅限于試管苗抗性分析，尚缺乏陽性植株對草銨膦耐受性分析的報道。抗除草劑轉基因作物對目標除草劑耐受性有一定限度，施藥劑量、施藥時期或施藥方式不當均會對作物產生不同程度的藥害，甚至會影響作物的品質和最終產量[19-21]。為此，本試驗選用隴薯3號轉Bar基因抗草銨膦馬鈴薯為研究對象，探究苗期噴施不同劑量的草銨膦對藥后不同時期雜草的數量，馬鈴薯生長、生理指標，成熟期馬鈴薯塊莖營養品質和單株產量的影響，考察成熟期土壤和塊莖中草銨膦的殘留情況，以明確草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防效及對馬鈴薯和環境的安全性，為草銨膦的科學使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗草銨膦轉基因馬鈴薯由甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所種質資源與生物技術研究室提供。供試草銨膦為10%水劑，由河北威遠生化農藥有限公司生產；草銨膦噴施器具為HD400背負式電動噴霧器(河北威遠生化農藥有限公司)。

1.2 試驗設計

試驗于2018年在甘肅省農業科學院蘭州試驗地隔離區進行。試驗共設4個處理，即于馬鈴薯出苗后20 d(2018年6月22日)分別噴施有效成分為0(清水對照，G0)、847.5(G1)、1 271.25(G2)和1 695(G3)g·hm-2的草銨膦，用水量均為 450 kg·hm-2。每個處理 3 次重復，小區面積15.44 m2(行長4.6 m，6行區，小區寬3.36m)，采用隨機區組排列，小區之間設隔離帶，寬度為1 m。小區間實行定向莖葉噴霧處理，噴霧周到均勻。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 馬鈴薯農藝性狀和產量調查 分別于施藥后30和45 d，每小區隨機選擇6株馬鈴薯，采用尺子測量植株株高[22](植株地上部分莖基部到生長點的高度，cm)；采用數顯游標卡尺緊貼土壤層測量莖粗，每株植株從正面和側面兩個方向測量，用平均值表示植株的莖粗(mm)[22]；根莖葉干重(g)采用烘干法測定，即測完鮮重(g)后，于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重。成熟期(10月2號)收獲的馬鈴薯塊莖按小區進行產量測定。

1.3.2 馬鈴薯生理指標和塊莖品質的測定 分別于施藥后1、4、11和20 d統一采集倒數第4片完全展開的葉片帶回實驗室進行生理指標的測定；收獲時每小區篩選長勢一致的馬鈴薯3株，每處理共計9株，分別裝袋帶回實驗室，用水沖洗表面泥土等雜質，晾干后用于干物質、淀粉、還原糖、維生素C和粗蛋白含量等品質性狀的測定。

參照鐘鵬等[23]的方法測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)和游離脯氨酸(proline，Pro)含量；參照唐鑫華等[24]的方法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；參考李雪等[25]的方法測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活性。

參照GB 5009.3-2016[26]采用直接干燥法測定干物質含量；參照NY/T 11-1985[27]采用旋光法測定淀粉含量；參照GB/T 5009.7-2016[28]采用直接滴定法測定還原糖含量；參照GB/T 5009.86-2016[29]采用熒光法測定維生素C含量；參照GB 5009.5-2016[30]采用凱氏定氮法測定粗蛋白含量。

1.3.3 草銨膦的除草效果和對馬鈴薯藥害的調查 施藥后15 d，肉眼觀察不同濃度草銨膦對雜草防治效果；分別在施藥后30和45 d，每小區按對角線取面積為1 m2的3個點，統計每個點的雜草數目，施藥后45 d統計完雜草數目后，整株拔出雜草并稱量地上部分的鮮重，按照公式分別計算雜草株防效(%)和鮮重防效(%)：

株防效=(對照區雜草株數-處理區雜草株數)/對照區雜草株數×100%

(1)

鮮重防效=(對照區雜草鮮重-處理區雜草鮮重)/對照區雜草鮮重×100%

(2)。

分別于藥后1、4、11和20 d, 對馬鈴薯表型進行仔細觀察，調查草銨膦是否對馬鈴薯造成藥害以及藥害癥狀。藥害癥狀參照馬國蘭等[31]的方法進行描述。

1.3.4 土壤和馬鈴薯塊莖中草銨膦殘留測定 收獲時，采集各小區的土壤和馬鈴薯塊莖，送至江蘇安舜技術服務有限公司，參照GB 23200.108-2018[32]采用LC-MS法進行草銨膦殘留檢測。

1.4 數據分析

采用 Microsoft Office Excel 2010整理數據；DPS V3.01軟件進行單因素方差(One-way analysis，ANOVA)統計分析；Duncan’s 法分析試驗結果的差異顯著性。所有數據均為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯生長的影響

由表1可知，與噴施清水對照(G0)相比，施藥后30 d各施藥處理的馬鈴薯苗均生長正常，未出現任何不良表現，說明試驗劑量的草銨膦對馬鈴薯沒有產生明顯藥害。藥后30 d，各處理組馬鈴薯平均株高為58.28～64.44 cm，平均莖直徑為9.54～10.49 mm，根莖葉的平均株鮮重為192.81～239.08 g，根莖葉的平均株干重為21.95～27.76 g。各處理間平均株高和莖直徑存在差異，但均未達到顯著水平。各劑量草銨膦處理的根莖葉鮮重、干重差異不大，但均顯著高于清水對照(G0)。

表1 施藥后30 d不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯生長的影響Table 1 Effects of different concent glufosinate on growth of transgenic glufosinate-resistant potato on 30 days after spraying glufosinate

注: 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

由表2可知，施藥后45 d，各處理馬鈴薯平均株高為63.17～67.39 cm，平均莖直徑為9.90～10.71 mm，根莖葉的平均株鮮重為205.50～239.87 g，根莖葉的平均株干重為22.97～31.47 g，收獲時各處理區馬鈴薯平均單株產量為415.13～649.77 g。各處理間株高和莖直徑的差異均未達到顯著水平；各施藥處理間的根莖葉鮮重、干重無顯著差異，但均顯著高于清水對照(G0)。收獲時單株產量依次表現為G3(649.77 g)>G2(610.08 g)>G1(558.82 g)>G0(415.13 g)，各施藥處理的單株產量隨著草銨膦濃度的增大而顯著增加，且均顯著高于清水對照(G0)。

因此，施藥后30 和45 d，試驗劑量的草銨膦對抗草銨膦馬鈴薯的生長發育并無負面影響，與清水對照(G0)相比，試驗劑量草銨膦均可以顯著提高單株產量。

表2 施藥后45 d時不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯生長和收獲時單株產量的影響Table 2 Effects of different concent glufosinate on growth of transgenic glufosinate-resistant potato on 45 days after spraying glufosinate and per plant yield at harvest time

2.2 不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯塊莖營養品質的影響

由表3可知，收獲后各處理馬鈴薯塊莖平均淀粉含量為16.24%～16.93%，平均干物質含量為17.83%～18.85%，平均粗蛋白含量為2.52%～2.68%，平均還原糖含量為0.42%～0.48%，平均維生素C含量為15.41～15.86 mg·100g-1。各處理間各指標的差異均未達到顯著水平，說明試驗劑量的草銨膦對抗草銨膦馬鈴薯的塊莖營養品質未造成明顯的負面影響。

表3 不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯塊莖營養品質的影響Table 3 Effects of different concent glufosinate on nutritional quality in tuber of transgenic glufosinate-resistant potato

2.3 不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯葉片生理指標的影響

由圖1可知，施藥后1～20 d，Pro含量隨著施藥時間的延長呈先降低后升高的趨勢，而MDA含量呈先升高后降低的趨勢，相同時期下，各處理的馬鈴薯葉片Pro和MDA含量均不存在顯著性差異。

注：不同小寫字母表示施藥后同一時間下各處理間差顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treaments at the same time after spraying glufasinate(P<0.05). The same as following.圖1 不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯葉片Pro含量和MDA含量的影響Fig.1 Effects of different concent glufosinate on concent of Pro and MDA in leaves of transgenic glufosinate-resistant potato

圖2 不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯葉片CAT活性和SOD活性的影響Fig.2 Effects of different concent glufosinate on activity of CAT and SOD in leaves of transgenic glufosinate-resistant potato

由圖2可知，施藥后1～20 d，CAT活性隨著施藥后時間的延長呈先升高后降低再升高的趨勢，SOD活性呈降低的趨勢(除G3外)。施藥后1和11 d，與清水對照(G0)相比，施藥處理的馬鈴薯葉片CAT活性均無明顯差異；施藥后4和20 d時，各處理的CAT活性有差異，但未達到顯著水平。施藥后1 d，與G0相比，施藥處理馬鈴薯葉片SOD活性均無明顯差異；施藥后4和11 d，G3處理葉片SOD活性顯著高于其他處理，但G1、G2與G0間均無顯著差異；施藥后20 d時，G3處理葉片SOD活性基本恢復到正常水平，與其他處理間無顯著差異。表明噴施試驗劑量的草銨膦對抗草銨膦馬鈴薯葉片的Pro和MDA含量、CAT和SOD活性均無顯著影響。

2.4 不同濃度草銨膦對抗草銨膦轉基因馬鈴薯田行間雜草的防治效果

在試驗地塊中雜草種類較多，主要包括闊葉雜草馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)、灰藜(ChenopodiumglaucumL.)、田旋花(ConvolvulusarvensisL.)、薺菜(Capsellabursa-pastorisL. Medic.)、反枝莧(AmaranthusretroflexusL.)、刺兒菜(CirsiumsegetumBungeeL.)和苣荬菜(SonchusbrachyotusDC)；禾本科雜草狗尾草(SetairaviridisL. Beauv.)、牛筋草(EleusineindicaL. Gaertn.)、旱稗(Echinochloahispidula(Retz.) Nees.)和野燕麥(AvenafatuaL.)。本研究沒有按雜草名稱逐一列舉，而是按照闊葉雜草和禾本科雜草兩大類進行統計調查。

由表4可知，施藥后30 d，各處理對闊葉雜草的平均株防效為39.75%～72.42%，株防效依次表現為G3(72.42%)>G2(58.26%)>G1(39.75%)；對禾本科雜草的平均株防效為54.30%～82.89%，株防效依次表現為G3(82.89%)>G2(64.44%)>G1(54.30%)。無論是闊葉雜草還是禾本科雜草，3個不同施藥劑量對雜草的株防效差異性均達到極顯著水平(P<0.01)，且隨著施藥劑量的增加株防效極顯著增加。施藥后45 d，各處理對闊葉雜草的平均株防效為31.90%～70.26%，株防效依次表現為G3(70.26%)>G2(56.00%)>G1(31.90%)；對禾本科雜草的平均株防效為52.51%～80.00%，株防效依次表現為G3(80.00%)>G2(62.43%)>G1(52.51%)。施藥后45 d各處理對闊葉雜草的平均鮮重防效為39.51%～86.64%，鮮重防效依次表現為G3(86.64%)>G2(54.78%)>G1(39.51%)；對禾本科雜草的平均鮮重防效為61.24%～85.23%，鮮重防效依次表現為G3(85.23%)>G2(70.34%)>G1(61.24%)，即G3對各類雜草的株防效和鮮重防效極顯著高于其他2個處理(P<0.01)。

表4 不同濃度草銨膦對轉基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防治效果Table 4 Control effect of different concent glufosinate to weeds in field of transgenic glufosinate-resistant potato

注: 不同小寫字母表示不同施藥劑量間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同施藥劑量間差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercasec letters mean significant difference among different dasages of glufosinate at 0.05 level. Different capital letters mean extremely significant difference among different dasages of glufosinate at 0.01 level.

2.5 土壤和馬鈴薯塊莖中的草銨膦殘留分析

由表5可知，各處理的土壤和塊莖中草銨膦的檢出量均小于規定量，未檢出草銨膦，表明試驗劑量的草銨膦均可以用于抗草銨膦轉基因馬鈴薯田間雜草的防治，不會產生農藥殘留危害。

3 討論

20世紀90年代轉基因作物開始商業化種植以來，關于抗除草劑轉基因作物田目標除草劑施用的研究也隨即展開，除草劑施用時間和施用劑量已成為研究熱點[33-36]。本研究中，在出苗20 d時，分別用含有效成分0、847.50、1 271.25、1 695.00 g·hm-2草銨膦藥劑定向噴施雜草和轉基因抗草銨膦馬鈴薯莖葉，從安全性來看，各藥劑定向噴霧施用于轉基因抗草銨膦馬鈴薯未產生明顯的藥害癥狀，與清水對照相比，收獲時各供試濃度均表現出明顯的增產作用，這與楊益善等[33]關于幼苗期噴施150～750 g·hm-2草銨膦對耐除草劑水稻產生藥害并產量呈下降趨勢的研究結果不同，這種差異可能與供試作物不同有關。即使在常規劑量下，除草劑對作物也是一種脅迫，有些作物表觀上無明顯的藥害癥狀，但是這種脅迫可能會引起作物體內生理特性的復雜變化[37]。本研究中，除根莖葉鮮干重顯著高于清水對照外，各處理馬鈴薯葉片的MDA和Pro含量、CAT活性，在藥后各時期與清水對照無顯著差異；藥后4和11 d，G3處理葉片SOD活性雖顯著高于其他處理，但藥后20 d時，G3葉片基本恢復到正常水平，與其他處理間無顯著差異。各施藥處理的馬鈴薯株高、莖直徑和薯塊營養品質與清水對照也無顯著差異，說明試驗劑量的草銨膦對馬鈴薯生理生化特性影響不大，這與姜偉麗等[34]的研究結果一致。

表5 草銨膦殘留檢測結果Table 5 Test results of glufosinate residues

從防治效果來看，綜合施藥后30和45 d結果，與清水對照相比，3種劑量的草銨膦對雜草均達到顯著防除效果，其中僅G3處理(有效成分1 695.00 g·hm-2)對闊葉雜草的平均株防效達到70%以上，對禾本科雜草的平均株防效達80%以上，其他處理對兩類雜草的株防效均在70%以下；G3處理(有效成分1 695.00 g·hm-2)對兩類雜草的平均鮮重防效均達85%以上，說明有效成分1 695.00 g·hm-2草銨膦藥劑對轉基因抗草銨膦馬鈴薯田行間雜草的防治效果最佳。因此，采用1 695.00 g·hm-2草銨膦藥劑可以有效防除轉基因抗草銨膦馬鈴薯田行間雜草，既不會對馬鈴薯造成藥害，也不會產生農藥殘留危害。草銨膦對抗草銨膦作物安全劑量可高達2 000 g·hm-2以上，使用高劑量草銨膦對轉基因作物有一定的傷害，但對產量影響不大[19，35]。本研究僅在轉基因抗草銨膦馬鈴薯的苗期，選擇推薦使用量的高、中、低劑量對馬鈴薯和田間雜草進行莖葉噴霧，調查草銨膦對田間雜草防治效果，同時分析了草銨膦對馬鈴薯及環境的安全性。而關于草銨膦對其他生育時期田間雜草的防除效果及馬鈴薯對更高劑量草銨膦的耐受性還有待進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，在轉基因抗草銨膦馬鈴薯的苗期，噴施不同劑量(1 695、1 271.25和847.5 g·hm-2)的草銨膦對雜草都有一定的防除效果，其中含有效成分1 695 g·hm-2的草銨膦對雜草的防治效果最好，株防效和鮮重防效均達70%以上。各劑量草銨磷不僅沒有對馬鈴薯造成藥害，在土壤和馬鈴薯塊莖中也沒有殘留，而且可以明顯提高馬鈴薯的單株產量。綜上，在轉基因抗草銨膦馬鈴薯的苗期，為了安全高效地防除雜草，可以用含有效成分1 695 g·hm-2的草銨膦進行莖葉噴霧。