花期鋪膜對蛇龍珠果實及酒品質(zhì)的影響

王 瑜，于素珍，肖慧琳，鄭秋玲，王 婷，劉萬好，曹志毅，唐美玲*

（1.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺 265500；3.威海市神山葡萄科技有限公司，山東 威海 264417）

“七分原料，三分釀造”指出釀酒葡萄果實品質(zhì)是釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的基礎(chǔ)。因此很多栽培措施都是圍繞如何提高釀酒葡萄果實品質(zhì)來進行的。近年來，果際微氣候調(diào)控是國內(nèi)外的研究熱點，尤其是摘葉研究[1-3]較多，但目前國內(nèi)對釀酒葡萄進行鋪膜研究較少。大多是對鮮食葡萄進行鋪膜處理[4-5]，結(jié)果均表明鋪設(shè)反光膜可增加果實中的可溶性糖和花色苷含量。而國內(nèi)外對釀酒葡萄進行鋪膜處理的研究表明，鋪膜處理都對釀酒葡萄果實及酒的品質(zhì)有不同程度的積極影響。李紅燕等[6]在樹冠下對赤霞珠進行鋪設(shè)銀色反光膜處理，結(jié)果表明鋪膜提高了可溶性固形物及糖的含量；OSRECAK M等[7]在薩格勒布大學(xué)實驗田分別對雷司令、塔明娜和白曼左尼在轉(zhuǎn)色期進行鋪設(shè)鋁制反光膜處理，結(jié)果表明三種葡萄酒中的總酚和黃酮醇含量都有所增加，其中對雷司令進行鋪膜處理的影響最顯著；COVENTRY J M等[8]在加拿大安大略省的尼亞加拉葡萄基地對品麗珠葡萄從花期前就進行鋪設(shè)鋁化聚乙烯薄膜處理，結(jié)果表明葡萄中的可溶性固形物、糖、總酚、黃酮醇及花色苷的含量都有不同程度的提升，其中黃酮醇的含量增加的程度高達未處理的36%。除此之外，鋪設(shè)反光膜還能減少有害昆蟲的數(shù)量，特別是蚜蟲和葉蟬，還可以抑制雜草的生長，減少了人力或者藥用除草的成本。

蛇龍珠是煙臺產(chǎn)區(qū)主栽的釀酒葡萄品種，抗病性、抗旱性、抗抽干能力較好，但穩(wěn)產(chǎn)性差、果粒偏大、降酸太快等缺點也比較突出，因此結(jié)合煙臺產(chǎn)區(qū)氣候特點以及蛇龍珠品種特性，本研究在花期對蛇龍珠進行鋪膜處理，研究鋪膜對果實和葡萄酒品質(zhì)的影響，為后期研究蛇龍珠配套栽培技術(shù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗在煙臺產(chǎn)區(qū)蓬萊市龍湖酒莊進行。選擇樹齡4年的蛇龍珠（CabernetGernischt），南北行向，行距2m，株距1m，采用單干單臂+直立葉幕整形。土壤為棕壤土，肥力中等。

丙酮、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、亞甲基藍、無水碳酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷鉬酸、單寧酸、氯化鉀、沒食子酸等（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（純度均＞98%）：上海M iragen公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；安琪CECA葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀、AA-56311有機相過濾器：安捷倫科技（中國）有限公司；GCMS-QP2010Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本津島公司；AL204分析電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；IKA MS3 basic渦旋振蕩器：艾卡儀器設(shè)備有限公司；Centrifuge5430R高速離心機：德國Eppendorf公司；H13237型超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗處理及采樣

實驗處理：選取長勢良好一致的植株，每10棵樹為一個處理，重復(fù)3次，各處理隨機排列?；ㄆ趯ζ咸烟傧逻M行鋪設(shè)反光膜處理，反光膜采用比利時博優(yōu)國際集團下屬的博優(yōu)技術(shù)紡織品（威海）有限公司生產(chǎn)的Lumilys L25反光地布，葡萄樹兩邊各鋪設(shè)40 cm，中間用園藝布釘連接。

采樣時間及檢測項目：從果實著色期（7月27日）開始到采收期（10月8日），間隔7～10 d采樣一次，共采樣7次，檢測總酚、花色苷、單寧及花色苷單體含量；采收期的葡萄分別用10 L玻璃罐進行葡萄酒釀造，檢測葡萄酒品質(zhì)的各項指標(biāo)。

采樣原則：當(dāng)天上午10：00～11：00采樣，分為上中下三部分平均采樣，隨機取樣200粒漿果，樣品采集后放入冰盒帶回實驗室，一部分直接放入-40℃冰箱內(nèi)備用，測定還原糖和可滴定酸含量；一部分剝?nèi)」し湃胍旱兴賰?，然后用研缽磨成粉末放入真空冷凍干燥機-40℃條件下冷凍干燥24 h，果皮粉保存在-40℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.2 果實品質(zhì)指標(biāo)的檢測方法

總酚含量（以沒食子酸計）的測定用福林肖卡法[9]；總花色苷含量（以二甲花翠素葡萄糖苷計）的測定用pH示差法[10]；單寧含量（以單寧酸計）的測定用福林丹尼斯法[11]。

選擇6個采樣時間（完全著色后至成熟期每7個工作日采樣一次）對葡萄果實進行花色苷總量和單體檢測，提取樣品果皮0.2 g加入1.5m L甲酸甲醇提取液后，研磨振蕩10min，離心后取上清液1m L用0.2μm濾膜過濾后，進行高效液相色譜法檢測[12]。

1.3.3 葡萄酒的釀制

成熟期采收后對處理及未處理的‘蛇龍珠’葡萄進行除梗后人工擠破壓碎，分別倒入10L玻璃罐，然后加入1000mg的CECA釀酒酵母及60mg/L的亞硫酸；在25℃條件下進行浸漬10 d（發(fā)酵過程中每日進行攪拌，讓上層的懸浮葡萄皮渣充分浸泡）；浸漬結(jié)束后使用紗布擠壓過濾，在玻璃罐中沉降7 d后分裝到酒瓶里進行打塞存儲。

1.3.4 葡萄酒品質(zhì)指標(biāo)的檢測方法

總酚含量（以沒食子酸計）用福林肖卡法[9]；總花色苷（以二甲花翠素葡萄糖苷計）用pH示差法[10]；單寧含量（以單寧酸計）的測定用福林丹尼斯法[11]；pH用pH計測定，酒精度用蒸餾法測定。

1.3.5 葡萄酒香氣成分的測定

用頂空固相微萃取法（headspace solid-phasemicroex traction，SPME）對香氣成分進行萃取濃縮。SPME萃取頭在使用前250℃老化30min，葡萄酒取5m L樣品置于20mL頂空瓶中，加入10μL 50μg/m L的2-辛醇（內(nèi)標(biāo)），將老化后的50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45℃吸附30min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250℃解吸3min。

GC-MS條件：載氣為純度99.9%的氦氣（He），流速為1m L/min。氣相色譜的頂空進樣口溫度為220℃，離子檢測器溫度為280℃，離子源溫度為230℃，連接線溫度為280℃。柱箱升溫程序為40℃保持2min后以3℃/min升溫到150℃保持2min，然后以10℃/min升溫到220℃保持2min。采集數(shù)據(jù)后經(jīng)MS-DIAL program 3.40軟件解卷積處理并計算保留指數(shù)，得到各保留時間的化合物名稱，峰面積及保留指數(shù)。

1.3.6 花色苷單體的測定

高效液相色譜條件：KromasilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速1.0m L/mim；柱溫30℃；進樣量20μL；檢測波長525 nm；流動相A甲酸∶水=1∶9，流動相B甲酸∶乙腈=1∶9。

采用外標(biāo)法進行定性和定量分析。準(zhǔn)確稱取花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷這5種標(biāo)準(zhǔn)品，用10%的甲酸溶液配制成質(zhì)量濃度為10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，在確定的色譜條件下上機測定，擬合5種花色苷的質(zhì)量濃度（Y）和峰面積（X），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進行定量分析。相關(guān)系數(shù)均在0.999 2以上，線性關(guān)系良好，符合高效液相色譜的標(biāo)準(zhǔn)。其他各類酰化花色苷參考梁振昌[13]的測定結(jié)果推斷色譜峰代表成分。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2010和IBM SPSSstatistics24軟件的單因素分析對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 花期鋪膜對蛇龍珠果實風(fēng)味物質(zhì)累積動態(tài)的影響

2.1.1花期鋪膜處理對果實總酚和單寧累積動態(tài)的影響

經(jīng)檢測沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.976 6x-0.025 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，所得總酚的積累動態(tài)見表1。由表1可知，花期鋪膜改變了蛇龍珠果實中總酚累積的變化趨勢。在本研究7個取樣時期中，花期鋪膜處理總酚呈現(xiàn)先升高達到最大值8.15 g/kg再降低到6.98 g/kg再升高至7.99 g/kg再降低至采收期的4.94 g/kg的趨勢，而對照組呈現(xiàn)先升高至8.24 g/kg再降低的趨勢。其中在9月18日和9月25日這兩個時期的經(jīng)過花期鋪膜處理的總酚含量顯著增加（P＜0.05），分別是對照組的1.07倍和1.39倍，但在采收期（10月8日）處理和對照總酚含量基本相同。而從表1中能夠得到花期鋪膜處理對葡萄總酚含量除了在9月18日和9月25日外其他時期都沒有達到顯著差異的影響（P＞0.05），因此，花期鋪膜只是改變了變化趨勢，對總酚合成沒有顯著的影響，這與TODIC S等[14]對赤霞珠進行鋪設(shè)白色反光膜處理后測定總酚含量無影響的結(jié)果是一致的。

表1 不同時期花期鋪膜與對照的總酚和單寧含量的對比Table 1 Comparison of totalphenoland tannin contentbetween reflective film in flowering stage and controlin differentperiods

經(jīng)檢測單寧酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0829x+0.0087，相關(guān)系數(shù)R2=0.995，所得單寧積累變化趨勢見表1。花期鋪膜果實中單寧含量的變化總體趨勢為逐漸降低，自7月27日達到最大值3.49g/kg，隨后逐漸降低，一直到采收時（10月8日）達到最低值1.46g/kg；而對照組單寧含量變化趨勢為先升高，至8月29日達到最大值，隨后在9月9日降低至最低值1.62 g/kg，之后一直比較平穩(wěn)。7月27日-8月21日和8月29日-9月25日這兩個時間段之間，花期鋪膜果實中單寧含量一直都是高于對照的，但是僅在9月18日達到了顯著差異（P＜0.05）。而且在采收時期，鋪膜處理的單寧含量低于對照的單寧，這與于詠等[15]的研究結(jié)果一致。由此可見，花期鋪膜對蛇龍珠的單寧的積累沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.1.2 花期鋪膜處理對果實花色苷動態(tài)積累的影響

選擇了6個采樣時期通過液相色譜法測定果皮中花色苷含量以及變化趨勢如表2所示。由表2可知，花期鋪膜和對照組中花色苷含量都是逐漸升高的，花期鋪膜沒有改變花色苷累積的變化趨勢。其中花期鋪膜處理果實中花色苷含量在采收期達到最大值7.71 g/kg，而對照組則是先升高隨后緩慢的降低然后再逐漸升高的趨勢，在采收期達到最大值6.06 g/kg；在本研究的6個采樣時期中，后4個時期的花期鋪膜的花色苷含量都是極顯著高于對照組（P＜0.01），在9月25日的花期鋪膜的花色苷含量比對照提高了44.53%。本研究表明花期鋪膜對促進花色苷合成具有積極作用，這與王立如等[5-6，16-17]的研究結(jié)果均一致。

表2 不同時期花期鋪膜與對照的花色苷含量的對比Table 2 Comparison of anthocyanin content between reflective film in flowering stage and control in different periods

2.1.3 花期鋪膜對果實中花色苷單體組成的影響

選擇采收期的果實進行花色苷單體檢測，結(jié)果如表3和表4所示。由表3可知，煙臺產(chǎn)區(qū)蛇龍珠果實中檢測出13種花色苷單體，這與其他地區(qū)檢測出的蛇龍珠單體數(shù)有明顯差異，如寧夏玉泉營[18-19]和甘肅省祁連地區(qū)[20]的蛇龍珠果實均檢測出了9種花色苷單體，山西鄉(xiāng)寧縣地區(qū)[21]檢測出了15種，每個產(chǎn)區(qū)的花色苷單體數(shù)量均不相同，這說明花色苷單體的種類數(shù)量可能與不同產(chǎn)區(qū)有關(guān)系?；ㄆ阡伳ぬ幚砉麑嵵兄粰z測出12種花色苷單體，比對照減少了花翠素-3-O-葡萄糖苷-5-O-香豆酰化葡萄糖苷單體。

表3 成熟時期花期鋪膜與對照的花色苷單體的分析Table 3 Analysis of anthocyanin between reflective film in flowering stage and control in mature periods

花期鋪膜和對照組均檢測出10種單葡萄苷花色苷，花期鋪膜處理果實中檢測出2種雙葡萄糖苷花色苷，對照果實中檢測出3種雙葡萄糖苷花色苷，二者共同檢測出的雙葡萄糖苷花色苷是花青素-3-O-香豆?；?5-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-咖啡?；?5-O-葡萄糖苷。雖然大多數(shù)研究表明，歐亞種葡萄只能以單葡萄糖苷花色苷形式存在，但是也有少數(shù)的研究表明部分歐亞種也存在雙葡萄糖苷[22-24]。另外，花期鋪膜組的二甲基花翠素類、香豆酰化花色苷、乙?；ㄉ找约翱Х弱；ㄉ蘸扛哂趯φ战M，其余花色苷含量均低于對照組。

表4 成熟時期花期鋪膜與對照的花色苷相對含量的對比Table 4 Comparison of the relative content of anthocyanin between reflective film in flowering stage and control in mature period%

煙臺產(chǎn)區(qū)蛇龍珠花色苷分為五類：花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、甲基花青素類和二甲基花翠素類。由表4可知，花期鋪膜和對照中含量最高的均是二甲基花翠素類，其次是甲基花翠素類，這與這與何英霞等[25]的研究結(jié)果一致。因為數(shù)據(jù)只能以相對含量顯示，但在總花色苷含量的對比中花期鋪膜處理顯著高于對照組（P＜0.05），所以二甲基花翠素類花色苷的含量也是明顯高于對照的。

2.2 花期鋪膜處理對葡萄酒品質(zhì)的影響

2.2.1 花期鋪膜對葡萄酒的理化指標(biāo)及總酚、總花色苷和單寧含量的影響

由表5可知，花期鋪膜對葡萄酒單寧含量影響極顯著（P＜0.01），含量為527.08mg/L，是對照的1.23倍；花期鋪膜葡萄酒中花色苷含量為3 268.80mg/L，僅比對照增加了7.32%；總酚僅是稍有增加，這與SANDLERH A[26]的研究結(jié)果相一致。花期鋪膜果實釀造的葡萄酒pH值較高，為4.15，而對照的為4.05，這與王輝等[27]的研究結(jié)果一致；花期鋪膜葡萄酒酒精度為14.2%vol，比對照高了2.2%vol。

表5 花期鋪膜與對照的葡萄酒中各指標(biāo)含量的對比Table 5 Comparison of the contentof various indicators between reflective film in flowering stage and controlwines

2.2.2 花期鋪膜對葡萄酒中香氣成分的影響

對蛇龍珠葡萄酒香氣成分進行檢測，結(jié)果如表6所示。由表6可知，花期鋪膜對酒中香氣種類沒有影響，均檢測出130種香氣物質(zhì)，其中包含醇類30種、醛類7種、酮類15種、酯類59種、酸類9種和萜烯類10種。但處理對香氣物質(zhì)含量有影響，除了醛類外其余的主要香氣物質(zhì)的總量均高于對照。其中含量最高的是醇類物質(zhì)，花期鋪膜處理的酒中醇類物質(zhì)的含量高達6 832.71μg/L，占總含量的41.63%；而對照的是5 342.23μg/L，占總含量的38.45%，花期鋪膜處理是對照的1.28倍?；ㄆ阡伳ぬ幚淼钠咸丫浦杏谐尸F(xiàn)特殊橙花香和玫瑰花香氣的物質(zhì)如1-辛醇、1-壬醇及1-癸醇[28]含量明顯高于對照組。

表6 花期鋪膜與對照的酒中各類香氣組分含量的對比Table 6 Comparison of the content of various aroma components between reflective film in flowering stage and controlwines

續(xù)表

其次是酯類物質(zhì)，鋪膜處理組含量為5 780.86μg/L，對照組為4 978.27μg/L。酯類香氣物質(zhì)中處理和對照的酒最高含量的均為具有果香、茴香味和甜味的辛酸乙酯，分別高達1 927.05μg/L和1553.19μg/L。兩種酒中均檢測出有特殊果香成分的乙酸乙酯、丙酸乙酯及丁酸乙酯等物質(zhì)，還有乙酸甲酯、乙酸正壬及月桂酸甲酯這類具有茴香味和花香味的物質(zhì)，另外還有具有白蘭地風(fēng)味的壬酸乙酯和辛酸異戊酯，具有蘑菇香味的乙酸正壬酯以及具有舒適醋味和脂肪香味的癸酸乙酯等物質(zhì)。這些特殊的酯類香氣物質(zhì)大多數(shù)都是處理含量比對照的高，這說明花期鋪膜處理能夠在一定程度上促進酒中花香、果香及特殊香氣的酯類物質(zhì)的積累，這與ROSSO C[29]研究結(jié)果一致。

鋪膜處理組和對照組的萜烯類化合物含量分別為3219.87μg/L和3019.54μg/L。在萜烯類香氣物質(zhì)具有特殊檸檬味和玫瑰味的物質(zhì)為芳樟醇、松油烯-4-醇、α-萜品醇、香葉醇和反式-橙花叔醇，雖然含量不高但是花期鋪膜處理過的酒樣中均高于對照酒樣。其中尤其重要的組分就是芳樟醇，它是一種單萜烯醇，有助于散發(fā)酒中濃郁的花香[30]，鋪膜處理的葡萄酒中含量是未處理的1.54倍，這與SASAKI K等[31]研究結(jié)果一致。含量相對較少的幾類就是酮類、醛類及酸類，并且有特征香氣的物質(zhì)含量大多數(shù)都是處理高于對照，如有奶油香氣的3-羥基-2-丁酮的含量甚至高達對照的5倍。3結(jié)論

花期鋪膜能夠顯著增加煙臺產(chǎn)區(qū)‘蛇龍珠’果實和葡萄酒中的總花色苷含量并且能夠促進花色苷中主要的單體—二甲基花翠素類花色苷的合成；還能夠提高葡萄酒中主要香氣物質(zhì)的含量以及促進特殊香氣物質(zhì)的合成，尤其是醇類、酯類和萜烯類的特殊香氣物質(zhì)；對于酒的品質(zhì)調(diào)控方面也有積極影響，但不是每個指標(biāo)都差異顯著。其中鋪膜處理對果實中總酚和單寧的含量沒有顯著的影響（P＞0.05）。由此可見，鋪膜處理不是對所有品質(zhì)指標(biāo)都有積極影響，因此一定要深入了解葡萄品種在當(dāng)?shù)匦枰纳颇男┢焚|(zhì)指標(biāo)之后，再探索尋找最經(jīng)濟適用的果際微氣候調(diào)控措施。