除膻菌株分離鑒定及其對膻味脂肪酸降解能力的研究

李秋桐，母應春，蘇 偉*

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

羊肉是一種藥食兼用的肉類食品，自古以來我國乃至世界人民就有食用羊肉的習慣。羊肉含豐富的動物蛋白，其消化率亦高，一些國家把羊肉列為上等食品[1]。羊肉不僅營養豐富，而且具有特殊的風味。羊肉的風味是由美拉德（Maillard）反應、脂質降解、硫胺素降解及其交互的一系列復雜反應形成[2]，但羊肉膻味在一定程度上影響了羊肉的品質，降低了人們對羊肉的可接受程度。WONGE等[3]研究發現，羊肉的這種特征風味物質主要來源于脂肪組織中由8～10個碳原子組成的不飽和脂肪酸。尤其是4-甲基辛酸和4-乙基辛酸，是引起膻味的主要支鏈脂肪酸。BERUNAND CP等[4]研究證明了4-乙基辛酸是形成山羊膻味的主要化合物。

目前，國內的除膻方法有民間中草藥脫膻和高溫加熱法等，同時開發了β-環狀糊精包埋法及自來水漂洗法[5]。目前微生物除膻技術得到很多學者的關注，其主要是利用有針對性的發酵制劑對羊肉進行發酵處理，以達到除膻的目的。近幾年國內許多學者運用發酵菌株制成發酵混合制劑，發酵過程中，微生物釋放的脂肪酶及蛋白酶類對羊肉的低級揮發性脂肪酸產生作用，降低了羊肉制品的膻味[6]，為發酵制品提供了特殊風味和色澤，且不會破壞羊肉制品的品質。穆莎茉莉[7]選用乳酸菌和酵母菌作為發酵劑，對羊肉進行發酵處理，羊肉的感官品質較好，且膻味較小。趙麗華[8]以內蒙古羊肉和羊尾脂肪作為原料，接種由產香肉葡萄球菌（Staphylococcuscarnosus）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）復合而成的發酵劑制成干香腸，發酵后的香腸在組織狀態、多汁性、滋味和整體可接受性上的感官評分明顯增加，其膻味下降也較明顯。

目前微生物除膻是國內除膻技術中相對較好的一種方法，但是要選擇合適的菌株一直是一個難題。實驗將培養基中的橄欖油替換成羊油，將乳化后的羊油和熒光指示劑加入到篩選平板中，篩選出作用于羊油脂的菌株，通過形態學、生化實驗及16S rRNA基因序列和轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）基因序列鑒定，然后將鑒定出的菌株作為發酵劑，通過液態發酵實驗分析其對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的降解作用，為微生物除膻技術提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

火腿：貴州盤縣某企業；土壤：貴州某羊養殖場。火腿和土壤采回后用無菌袋密封，于4℃條件下保存。

1.1.2 試劑

4-甲基辛酸標準液（純度≥98.0%）、4-乙基辛酸標準液（純度≥98.0%）：美國Sigma公司；甲醇、正己烷（均為色譜純）：美國天地有限公司；氫氧化鉀（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：重慶川東化工有限公司。

1.1.3 培養基

富集培養基和初篩培養基：參照參考文獻[9]并稍作修改。用2 g/100m L的聚乙烯醇乳化羊油，羊油∶聚乙烯醇=1∶4（g∶g）。

細菌保藏培養基：參照參考文獻[10]；真菌保藏培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextroseagar，PDA）培養基。

種子培養基和發酵培養基：參照參考文獻[11]并稍作修改。用2 g/100mL的聚乙烯醇乳化羊油，羊油∶聚乙烯醇=1∶4（g∶g）。

1.2 儀器與設備

Trace DSQ氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國Finnigan公司；HP-FFAP色譜柱（50m×0.20mm，0.25μm）：美國安捷倫科技有限公司；CX21BIM-SET5奧林巴斯生物顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；VITEK2Compact梅里埃全自動微生物生化鑒定儀：法國生物梅里埃公司；BILON88-II超聲波細胞粉碎機：上海比郎儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

稱取火腿表皮肉100 g，切碎置于滅菌三角瓶中備用；稱取土壤100 g，置于滅菌三角瓶中，60℃條件下烘干至泥土松散，備用。

1.3.2 富集培養

取上述處理的樣品各10g，置于90m L無菌生理鹽水中，180 r/m in振蕩30m in。靜置分層后取5m L上清液于50m L富集培養基中，30℃、180 r/min培養48h，再取5m L裝入50m L新鮮富集培養基中，進行第2、3次富集。

1.3.3 產脂肪酶菌株的分離和保存

吸取富集培養的菌液1m L置于9m L無菌生理鹽水中，隨后以10倍為稀釋單位進行稀釋，逐步稀釋至10-5、10-6、10-7。從這3個稀釋度的菌液中各取1m L注入平板中，并趁熱倒入初篩培養基，每個濃度做3個平行，待其冷卻凝固于30℃恒溫培養箱中倒置培養72 h。培養好的平板置于波長365 nm的紫外光下觀察，若平板上的菌落產生熒光圈則說明該菌落產生脂肪酶。挑選熒光圈較大的細菌菌落和真菌菌落于新的初篩平板上劃線分離，以獲得單菌落并再次驗證該菌株水解羊油脂的能力。將分離得到的單菌落編號并接種于斜面培養基上，培養48 h于4℃條件下保存。

1.3.4 菌株形態觀察

將分離出的細菌和霉菌分別接種于細菌保藏培養基和真菌保藏培養基上，30℃條件下恒溫培養72 h，觀察菌落形態。分別挑取細菌的單個菌落和霉菌的菌絲置于載玻片上進行染色制片，顯微鏡下觀察其染色情況、菌體形態并記錄結果。并根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[12]和《真菌鑒定手冊》[13]進行菌株形態學鑒定。

1.3.5 細菌生理生化鑒定

采用梅里埃VITEK2Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統對分離純化出的細菌菌株進行分析。

1.3.6 菌株分子生物學鑒定

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取：利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取目標菌株基因組DNA。采用通用引物27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增菌株的16S rRNA基因。PCR擴增體系：基因組 DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5mmol/L）1 μL，酶0.2μL，27F（10μmol/L）0.5 μL，1429R（10μmol/L）0.5μL，加雙蒸水（ddH2O）至25μL。PCR擴增條件：94℃預變性4min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1min，共30個循環；最終72℃延伸10m in。純化后的菌株基因組DNA采用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測；PCR擴增產物的測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，采用16S rDNA測序方法對菌株進行分子生物學鑒定。

真菌基因組DNA提取：利用真菌基因組DNA提取試劑盒提取目標菌株基因組DNA，具體操作步驟參見試劑盒說明書。采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）PCR擴增菌株的基因。PCR擴增體系：基因組DNA（20～50ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5mmol/L）1 μL，酶0.2 μL，ITS1（10 μmol/L）0.5 μL，ITS4（10 μmol/L）0.5 μL，加ddH2O至25μL。PCR擴增條件：94℃預變性4m in；94℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72℃延伸1min，共30個循環；最終72℃延伸10m in。純化后的菌株基因組DNA采用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測；PCR擴增產物的測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，采用ITS測序方法對菌株進行分子生物學鑒定。

登陸美國國家生物信息中心（nationalcenterofbiotechnology information，NCBI）數據庫，將測序結果與GenBank數據庫已知序列進行BLAST對比，選取相似性99%以上的菌株序列，采用MEGA5.05軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.7 菌株降解脂肪酸的測定

準確稱取4-甲基辛酸和4-乙基辛酸各150.0mg，用正己烷定容至500m L，即為脂肪酸標準混合溶液；在150m L三角瓶中加入30m L液體發酵培養基，20m L脂肪酸標準混合溶液，種子菌液以體積分數5%的接種量接入液體培養基；30℃、180 r/min條件下培養48h，取出加入10m L正己烷充分振蕩，8 000 r/m in離心20m in，取上清液甲酯化[14]，采用GC-MS法測定兩種脂肪酸含量。

1.3.8 脂肪酸含量的測定

GC條件：HP-FFAP色譜柱（50m×0.20mm，0.25μm）；升溫程序：初始溫度100℃，保持2m in，以6.0℃/m in升至220℃，保持10min；載氣為氦氣（He），流速1.0m L/min；進樣口溫度270 ℃；分流比10∶1；進樣量1.0μL；傳輸線溫度230℃。MS條件：離子源溫度220℃；電子電離（electron ionization，EI）離子源；電子能量70eV；選擇離子監測（selected ionmonitor，SIM）掃描模式。

2 結果與分析

2.1 產脂肪酶菌株的分離篩選結果

從火腿和土壤中共分離出6株產脂肪酶的細菌，編號分別為QT1-2、QT3-1、QT3-2、ZH1-1、ZH2-1、ZH2-2；5株霉菌，編號分別為TZH1、TZH3、TZH4、QT6-2、4TQ3。

2.2 產脂肪酶菌株的鑒定

2.2.1 形態特征和生理生化特征

細菌及霉菌菌落特征如表1所示，細菌及霉菌菌體形態如表2、表3所示。通過梅里埃VITEK2Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統的分析，細菌的生理生化鑒定卡如表4所示。結合《伯杰氏系統細菌學手冊》鑒定分類系統和生理生化鑒定結果，初步判定菌株QT1-2為普羅維登斯菌屬（Providencia），菌株QT3-1和ZH1-1為克雷伯氏菌屬（Klebsiella），菌株QT3-2為腸桿菌屬（Enterobacter），菌株ZH2-1為假單胞菌屬（Pseudomonas），菌株ZH2-2為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）。根據《真菌鑒定手冊》中的鑒定分類系統，可初步判定菌株TZH1和TZH3為根霉屬（Rhizopus），菌株THZ4和QT6-2為曲霉屬（Aspergillus），菌株4QT3為橫梗霉屬（Lichtheimia）。

表1 細菌和霉菌菌落特征Table 1 Colony characteristics of bacteria and mold

表2 細菌菌體形態Table 2 Mycelialmorphology of bacteria

表3 霉菌菌體形態Table 3 Mycelialmorphology ofmold

表4 細菌的生理生化特征Table 4 Physiologicaland biochem ical characteristics of bacteria

2.2.2 產脂肪酶菌株的分子生物學鑒定

圖1 6株細菌的16S rRNA PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of 16S rRNA PCR amplification products of 6 strains of bacteria

圖2 5株霉菌的ITS PCR擴增產物電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of ITS PCR am plification products of 5 strains ofmolds

由圖1可知，將篩選得到的6株細菌以總DNA為模板PCR擴增后經電泳檢測，均得到了1.5 kbp左右的條帶。由圖2可知，將篩選得到的5株霉菌以總DNA為模板PCR擴增后經電泳檢測，均得到了600 bp左右的條帶。PCR擴增產物由上海生工公司進行測序，測得它們的序列并與GenBank數據庫已有的序列比對，選取同源性＞99%的菌株序列構建系統發育樹，結果見圖3和圖4。

圖3 細菌基于16S rRNA基因序列的6株細菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of six strains of bacteria based on 16S rRNA gene sequences

圖4 基于ITS基因序列的5株霉菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of five strainsmolds based on ITS gene sequences

由系統發育樹結合菌落、菌體形態和生理生化特征可以看出，菌株QT1-2與產堿普羅維登斯菌親緣性最高（100%），因此鑒定為產堿普羅維登斯菌（Providencia alcalifaciens）；菌株QT3-1與肺炎克雷伯氏菌親緣性最高（100%），因此鑒定為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）；菌株QT3-2與霍式腸桿菌親緣性最高（100%），因此鑒定為霍式腸桿菌（Enterobacterhormaechei）；菌株ZH1-1與產酸克雷伯氏菌親緣性最高（100%），因此鑒定為產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）；菌株ZH2-1與銅綠假單胞菌的親緣性最高（100%），因此鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）；菌株ZH2-2與弗氏檸檬酸桿菌親緣性最高（97%），因此鑒定為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii）。菌株TZH1與微孢根霉親緣性最高（100%），因此鑒定為微孢根霉（Rhizopus microsporus）；菌株TZH3與米根霉親緣性最高（99%），因此鑒定為米根霉（Rhizopusoryzae）；菌株TZH4與米曲霉親緣性最高（100%），因此鑒定為米曲霉（Aspergillus oryzae）；菌株QT6-2與黃曲霉親緣性最高（99%），因此鑒定為黃曲霉（Aspergillus flavus）；菌株4QT3與多枝橫梗霉親緣性最高（100%），因此鑒定為多枝橫梗霉（Lichtheim ia ramosa）。

普羅威登斯菌屬（Providencia）菌為革蘭氏陰性，屬腸桿菌科，是人和動物腸道的正常菌群，也是條件致病菌，能引起腹瀉，腸道外感染和尿道感染等疾病[15]。張遷[16]對一種來源于普羅維登斯菌的酸性脲酶進行了研究，這種酶能在發酵酒苛刻環境下高效分解尿素，逐漸受到人們的關注。克雷伯氏菌屬（Klebsiella）普遍存在于土壤、水體、谷物等自然環境以及生物體的消化、呼吸系統中[17]。LIU Y等[18]從中國西雙版納土壤中篩選獲得一株含漆酶基因（lac）的肺炎克雷伯氏菌，該漆酶具有良好的pH和溫度穩定性，可廣泛應用于紡織業、造紙工業、食品行業中等。產酸克雷伯氏菌（K lebsiella oxytoca）則能產生賴氨酸脫羧酶，被GALEEF等[19]用于定量分析賴氨酸的含量等。霍氏腸桿菌（Enterobacterhormaechei）屬于腸桿菌屬（Enterobacter），存在于人和動物腸道，為正常菌群之一。岳喜慶等[20]從一株霍氏腸桿菌中提取了一種青霉素酶，這種酶主要用于對牛奶中青霉素殘留量的快速定量測定，并對其發酵產酶條件進行了初步的研究。弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii）是一種生長能力強的典型人-畜-魚共患條件致病菌，感染致病性弗氏檸檬酸桿菌后可引起動物和人腹瀉、肺炎、敗血癥及食物中毒等癥狀[21]。羅會穎等[22]從弗氏檸檬酸桿菌中分離出一種新植酸酶并對其酶學性質研究，植酸酶可作為單胃動物的飼料添加劑，提高植物性飼料磷的利用率等。以上細菌能產生不同的酶并應用于不同領域，但對其脂肪酶的應用卻鮮有報道，具有一定的研究前景。

微孢根霉可產生纖維素酶[23]和脂肪酶[24]等，用于處理油脂含量高達1 300mg/L的乳制品廢水，35℃條件下發酵72 h后，油脂含量降低至300mg/L以下。米根霉（Rhizopus oryzae）和米曲霉（Aspergillusoryzae）是發酵工業中的重要霉菌，通常應用于腐乳[25]和醬油[26]等發酵食品中。朱東奇等[27]發現，一株米根霉所產脂肪酶具有水解鳀魚油富集二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）的應用潛能。廖焰焰等[28]從豆豉中分離篩選出一株高產脂肪酶菌株，在豆豉發酵過程對其外觀及風味的變化具有重要影響，以期為豆豉工業化生產提供理論依據。譚婷婷等[29]從北方黃酒麥曲中篩選出多枝橫梗霉，其產脂肪酶的研究卻未見報道。2.3菌株對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的降解

各菌株發酵后，所測得脂肪酸含量如表5所示，各菌株發酵后4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的含量都明顯減少。由于這兩種辛酸本身具有一定的揮發性，在不接種菌液的空白對照組中，4-甲基辛酸的減少量達到31.03%，4-乙基辛酸的減少量達到30.36%，所示實驗組中4-甲基辛酸的實際減少量為30%～70%之間，而4-乙基辛酸的實際減少量為10%～70%之間。

表5 菌株發酵后脂肪酸含量Table 5 Fatty acid contents after strains fermentation

3 結論

本研究以篩選產脂肪酶菌株的經典方法為基礎進行改良，用乳化羊油代替其中的橄欖油，能準確分離篩選出作用于羊油脂的產脂肪酶菌株。成功分離出6株細菌，分別為QT1-2、QT3-1、QT3-2、ZH1-1、ZH2-1、ZH2-2；5株霉菌，分別為TZH1、TZH3、TZH4、QT6-2、4TQ3。這12株菌均能產生脂肪酶，菌落在波長365 nm的紫外光下均能觀察到熒光圈。通過形態觀察、生理生化鑒定和分子生物學鑒定，最終確定菌株QT1-2為產堿普羅維登斯菌（Providenciaalcalifaciens），菌株QT3-1為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae），菌株QT3-2為霍式腸桿菌（Enterobacterhormaechei），菌株ZH1-1為產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），菌株ZH2-1為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌株ZH2-2為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii）；菌株TZH1為微孢根霉（Rhizopusmicrosporus），菌株TZH3為米根霉（Rhizopusoryzae），菌株TZH4為米曲霉（Aspergillusoryzae），菌株QT6-2為黃曲霉（Aspergillusflavus），菌株4QT3為多枝橫梗霉（Lichtheimiaramosa）。

用分離得到的11株菌對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的混合溶液進行發酵，結果表明，這11株均對這兩種脂肪酸具有降解作用，其中4-甲基辛酸的減少量為10%～70%之間，而4-乙基辛酸的減少量為10%～70%。其中菌株TZH1、TZH3、TZH4和4QT3能應用于食品工業，而其余7株菌為條件致病菌，不能直接應用于食品，但可以通過基因工程等手段，對其降解膻味脂肪酸的基因片段進行研究及應用。對產脂肪酶菌株的分離鑒定及其對膻味脂肪酸降解能力的研究可以為今后羊肉除膻和發開新型羊肉制品奠定基礎。