利用金銀花蒸餾殘液生物轉化總黃酮工藝優化

魯司卿，余晨敏，向 福，2*，熊天涵，曹 城，胡宗濤，周立金

（1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室 黃岡師范學院，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃岡 438000）

金銀花（Lonicera japonica Thunb），亦稱為雙化、銀花，忍冬等，是一種忍冬科半常綠藤木植物，其性甘寒、氣芳香，在中醫藥學中多作為宣散風熱、清解血毒等配方，對治療熱毒瘡癰、咽喉腫痛、發疹等各種熱性病具有很好的效果[1-2]。

湖北羅田縣位于大別山南麓，具有典型的山地氣候特征，野生金銀花資源豐富，“羅田金銀花”香氣濃郁、揮發油含量高，2011年獲批中國地理標志產品，且羅田金銀花種植面積已達2.1萬畝，推動了地方以金銀花露加工為代表的金銀花產業發展[3-5]。金銀花露加工后的蒸餾剩余物中含黃酮、綠原酸等生物活性成分[6]，本地的金銀花加工企業都面臨蒸餾剩余物資源化利用的問題。

現代研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤[7-8]、清除自由基[9]、抗突變[10]、抗菌、抗病毒[11]、調節免疫、保肝利膽、防治血管硬化[12-13]、降血糖和抗人類疫缺陷病毒（human im munodeficiency virus，HIV）活性[14-15]等功能。近年來人們越來越關注微生物轉化植物次生代謝產物[16]，其在天然產物和中藥活性物質成分的開發及工業化應用方面應用前景廣闊[17-19]。本試驗擬以地方企業加工金銀花露后的蒸餾剩余物為材料，篩選轉化總黃酮的微生物并探討其最佳轉化工藝條件，從而為地方企業綜合利用金銀花資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花蒸餾剩余物：湖北楚天舒藥業有限公司提供，過濾后濾液備用；枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、黑曲霉（Aspergillusniger）：均由黃岡師范學院生物與農業資源學院生物工程實驗室提供。

蘆丁標準品（純度≥95%）：上海金橞生物科技有限公司；乙醇（分析純）：上海山浦化工有限公司；NaNO2（分析純）、Al（NO3）3（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；NaOH（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司。

察氏培養基[20]：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KCl0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1 L，pH自然，121℃滅菌20m in。

1.2 儀器與設備

VarianCary100Scan型紫外可見分光光度計：美國Varian公司；Ax-205METTLERTOLEDO型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；H/T18MM型臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；HYG-B型全溫度搖瓶柜：太倉市實驗設備廠；YM 50型不銹鋼立式電熱滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線制備及總黃酮含量測定

根據陳瑤等[21-22]報道的方法，準確稱取蘆丁標準品10.66mg，用體積分數60%乙醇溶液配制成母液，分別取母液0、1.00m L、2.00m L、3.00m L、4.00m L、5.00mL、6.00m L于25m L容量瓶中，加入體積分數60%乙醇溶液5.50mL，加入5%亞硝酸鈉1m L后搖勻放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1mL之后搖勻放置6min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10m L，并用體積分數為60%乙醇溶液定容至刻度線，放置15m in后，以未加入標準品溶液的試劑為空白，在波長509 nm處檢測其吸光度值，以蘆丁質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，制得蘆丁標準曲線回歸方程A=12.197C+0.004 2，R2=0.999 5，蘆丁質量濃度在8.6～59.7 μg/m L范圍內與吸光度值線性關系良好。

樣液按照蘆丁標準曲線制備方法進行處理，并在波長509 nm處測定其吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算總黃酮含量，試驗重復3次。

1.3.2 菌種篩選

據刁歡等[23-24]的研究發現，黑曲霉和枯草芽孢桿菌對總黃酮的轉化有促進作用，本驗試分別在相同的試驗條件下測定其總黃酮增量，篩選出能使發酵液相比于母液總黃酮增量最高的一種菌用于后續試驗。

1.3.3 總黃酮轉化工藝條件優化單因素試驗

取150m L液體察氏培養基于500m L錐形瓶，滅菌后接入黑曲霉，放入轉速為150 r/min的搖床30℃培養3 d左右至長出菌絲制得黑曲霉菌液。

根據溶氧量設定液體發酵液容器為500m L錐形瓶，總發酵液體系為150m L：先加入察氏液體培養基30m L和一定體積的蒸餾剩余物液，121℃條件下滅菌20m in，冷卻，按0.92×106CFU/m L接入黑曲霉菌液，蒸餾剩余物液和菌液總體積為120m L。之后放入轉速150 r/m in，溫度30℃的搖床培養6 h，離心，測定總黃酮含量。

根據樣品液與對照液（不接菌種，其他條件與樣品液一致）的總黃酮含量，計算樣品液在菌種發酵作用下的總黃酮增量。以總黃酮增量為評價指標，通過單因素試驗分別考察不同發酵時間（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）、接種量（0.61×106CFU/m L、0.92×106CFU/m L、1.23×106CFU/m L、1.38×106CFU/m L、1.47×106CFU/m L）、發酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）和轉速（0、50 r/m in、150 r/m in、200 r/m in、250 r/min）對總黃酮增量的影響。

1.3.4 總黃酮轉化工藝條件優化正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，選取對總黃酮增量影響較顯著的發酵時間、接種量、發酵溫度和轉速這四個因素進行正交試驗設計，因素與水平如表1所示。

表1 總黃酮生物轉化工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for total flavonoids bioconversion process optim ization

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

枯草芽孢桿菌和黑曲霉發酵金銀花蒸餾剩余物后總黃酮含量變化情況見表2。由表2可知，枯草芽孢桿菌對總黃酮含量的增加無效果，而黑曲霉對總黃酮含量有較明顯作用，總黃酮增加0.32 g/L，因此，轉化菌株宜選黑曲霉。

表2 2種菌種對總黃酮增量的影響Table 2 Effect of two strains on the increment of total flavonoids

2.2 總黃酮生物轉化工藝優化單因素試驗

2.2.1 發酵時間對總黃酮增量的影響

由圖1可知，在其他條件相同的情況下，當發酵時間從4 h延長到8 h時，總黃酮增量增長緩慢，且發酵6 h到8 h總黃酮增量無顯著差異（P＞0.05），發酵8 h到10 h期間總黃酮增量迅速增加，在10 h時增量達到峰值，即0.41 g/L，繼續增加發酵時間，總黃酮增量逐漸降低。可能由于培養時間過長，菌體數量過多，導致菌株營養和溶氧不足，發酵轉化總黃酮能力下降，故以發酵時間10 h為宜。

圖1 發酵時間對總黃酮增量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the increment of total flavonoids

2.2.2 接種量對總黃酮增量的影響

由圖2可知，隨著接種量的逐漸增加，即同等體系下菌液占比的逐漸增加而金銀花蒸餾剩余物液占比的逐漸減少，總黃酮增量呈先升高后降低的趨勢，總黃酮增量在接種量為1.23×106CFU/m L條件下達到峰值，為0.44 g/L。繼續增加接種量，總黃酮增量下降。這主要是由于接種量過高，黑曲霉菌體生長迅速，大量營養物質被消耗，不利于總黃酮的轉化。因此，接種量以1.23×106CFU/m L為宜。

圖2 接種量對總黃酮增量的影響Fig.2 Effect of inoculum on the increment of total flavonoids

2.2.3 發酵溫度對總黃酮增量的影響

圖3 發酵溫度對總黃酮增量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the increment of total flavonoids

溫度可以直接影響著各微生物的生長、生化反應速率及黃酮的提取率、穩定性[25]。由圖3可知，發酵的溫度＜30℃之前，隨著溫度的升高，總黃酮增量逐漸升高，總黃酮增量在30℃的恒溫條件下達到峰值，為0.50g/L。繼續升高發酵溫度至40℃，總黃酮增量隨著發酵溫度的升高而明顯下降，可能是因為溫度過高消耗營養物質速度加快，菌體更易衰老，從而影響菌體的生長最終導致總黃酮增量降低。因此，發酵溫度以30℃為宜。

2.2.4 轉速對總黃酮增量的影響

由圖4可知，隨著轉速的增加，總黃酮增量逐步上升，當轉速增加至150 r/min時總黃酮增量達到最大，為0.33 g/L。繼續增加轉速，總黃酮增量略有下降。主要是因為剪切力太大導致菌絲體斷裂從而不利于黑曲霉的生長，導致總黃酮增量降低。因此，轉速以150 r/min為宜。

圖4 轉速對總黃酮增量的影響Fig.4 Effect of rotating speed on the increment of total flavonoids

2.3 總黃酮生物轉化工藝優化正交試驗

根據單因素試驗結果，以發酵時間（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）、轉速（D）為變量因子，以總黃酮增量為評價指標，設計L9（43）正交優化試驗，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 總黃酮生物轉化工藝優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonalexperiments for total flavonoids bioconversion process optim ization

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonalexperim ents results

由表3的極差分析結果可知，各因素對總黃酮增量的影響次序為B＞A＞C＞D，即接種量＞發酵時間＞發酵溫度＞轉速。表4方差分析也表明各個因素對總黃酮增量的影響次序是B＞A＞C＞D，但各因素的影響均不顯著（P＞0.05），獲得最佳發酵工藝條件為A2B1C2D3，即發酵時間10 h，接種量0.92×106CFU/m L，發酵溫度30℃，轉速200 r/min。

2.4 驗證試驗

最佳發酵工藝條件，即發酵時間10 h，接種量0.92×106CFU/m L，溫度30 ℃，轉速200 r/m in，為表3中的4號試驗，其總黃酮增量最高；在此條件下平行驗證試驗3次，總黃酮增量為（2.54±0.48）g/L，與理論值2.51 g/L結果較一致，表明正交設計所確定的黑曲霉發酵條件為最優選。

3 結論

針對本地企業加工金銀花露后的蒸餾剩余物液，利用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉四種微生物進行發酵試驗，發現黑曲霉能明顯轉化提高蒸餾剩余物液中總黃酮含量，為優選轉化菌株。以總黃酮增量為評價指標，利用正交試驗優化黑曲霉發酵工藝為發酵時間10h，接種量0.92×106CFU/m L，發酵溫度30℃，轉速200 r/min。在此優化條件下，黑曲霉轉化金銀花蒸餾剩余物中總黃酮增量可高達（2.54±0.48）g/L。該工藝簡單有效，適合工業化生產，從而為地方企業對加工金銀花露后的蒸餾殘液進行資源化利用提供了依據。