三相萃取黃參蛋白質及其抗氧化性分析

張喜峰，程雯慧，張春梅*

（1.河西學院 農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

黃參（Sphallerocarpusgracilis）為多年生傘形科迷果芹屬植物，在國內主要分布于新疆、甘肅等西北地區，具有食用歷史較長、營養成分豐富等特點，其中多糖、蛋白質含量較高，與世界衛生組織推薦的參照蛋白模式基本吻合，屬于優質蛋白質；應用前景廣闊[1]；目前，國內外研究主要集中在黃參多糖、多酚和黃參食品開發等方面[2-5]；而有關黃參蛋白質（Sphallerocarpus gracilis protein，SGP）的應用研究相對較少；蛋白質采用初級分離鹽析沉淀后，采用柱層析進行后續純化步驟，雖純度高，但步驟繁瑣，周期較長，不利于工業化生產[6]。

三相萃取（three phase-partitioning extraction，TPPE）是基于一種液-固-液形成三相基礎上非色譜分離技術，具有簡單、快速、成本低、回收率高等特點[7]；其主要由一定量無機鹽（通常為硫酸銨）、蛋白質粗提液和小分子親水性有機溶劑（通常為叔丁醇）充分混合，靜置一段時間后，即可形成多酚類成分主要富集在上相即叔丁醇相，中間相為分離的蛋白質，下相主要為多糖和其他親水物質；三相的形成與鹽的濃度、表面張力和滲透作用密切相關[8]。羅磊等[9]采用叔丁醇/硫酸銨三相體系萃取金銀花過氧化物酶，并對其酶學性質進行了分析；GAGAOUA M等[10]采用三相萃取分離甜瓜汁中甜瓜蛋白酶，獲得了最佳萃取條件；AVHADDN等[11]對纖溶酶超聲輔助三相萃取條件進行了優化；其溫和的分離環境在天然產物活性成分分離和純化過程中具有重要作用，已廣泛應用于金屬、油脂、酶等有效成分的分離[12-14]。

本研究擬對黃參中蛋白質進行三相萃取研究，通過單因素和正交試驗優化其萃取條件，采1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除率、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidantpower，FRAP）值和氧自由基吸收能力（oxygen radicalabsorbance capacity，ORAC）對黃參中蛋白組分抗氧化性進行研究，以期為黃參中蛋白質的深度開發和工業化生產提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃參：采自甘肅山丹縣，經張春梅副教授鑒定為迷果芹屬（Sphallerocarpus）傘形目傘形屬；經清洗、陰干、粉碎后過60目篩，低溫保存備用。叔丁醇、硫酸銨、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津永晟精細化工有限公司；維生素C（vitamin C，VC）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DFY-1000C小型粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；恒溫磁力攪拌器；陜西環宇儀器設備公司；PHS-25/25C精密臺式pH計；遼寧賽亞斯科技有限公司；L6S紫外可見分光光度計；上海重逢科學儀器有限公司；GDXL-16D低速低溫離心機：常州市凱航儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃參蛋白質提取液制備

稱取一定量黃參粉末按照料液比1∶50（g∶m L）加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7），在25℃振蕩處理30m in后，在4 000 r/min離心10m in，上清液為黃參蛋白質提取液。

1.3.2 黃參蛋白質三相萃取技術

取100m L已制備的黃參蛋白質提取液，加入固體硫酸銨使其飽和度為20%～60%，采用1mol/LHCl或1mol/L NaOH調節體系pH為3.5～5.5，按照提取液∶叔丁醇體積比（1.0∶0.1～1.0∶2.5）加入一定量的叔丁醇后，充分混勻，在20～40℃水浴處理15～35m in，在4 000 r/m in離心10m in，收集含黃參蛋白質的中間相，經冷凍干燥（-45℃干燥24 h，真空度10 Pa）后得黃參蛋白質組分，命名為SGP-1。

1.3.3 傳統鹽析沉淀黃參蛋白質

取100m L已制備的黃參蛋白質提取液，加入31.3 g固體硫酸銨，對其進行分級沉淀，經離心、透析除鹽、冷凍干燥（-45℃干燥24 h，真空度10 Pa）得黃參蛋白質組分，命名為SGP-2。

1.3.4 黃參蛋白質含量測定及提取率計算

采用凱氏定氮法測定黃參蛋白質含量[15]，蛋白質提取率計算公式如下：

1.3.5 黃參蛋白質體外抗氧化活性測定

（1）DPPH·清除能力測定

SRP-1、SRP-2的抗氧化性測定參考文獻DPPH自由基清除法[16]，略作修改；分別取不同質量濃度（0.2～1.0mg/mL）SGP-1和SGP-2各2m L，加入0.2mmol/LDPPH溶液2.0m L，在室溫避光反應30min后在波長519 nm處測定其吸光度值，以VC為陽性對照，DPPH·清除率計算公式如下：

（2）ABTS+自由基清除能力測定

參照文獻[17]方法略作改動：將4.9mmol/L過硫酸鉀和7mmol/L ABTS+溶液等體積混合后，室溫避光反應12 h后，采用0.45μm有機相針式濾器對青綠色ABTS+溶液進行過濾后，采用甲醇稀釋，其波長734 nm處的吸光度值為0.70±0.02。分別取不同質量濃度（0.2～1.0mg/m L）SRP-1和SRP-2各150μL，加入ABTS+溶液2.85m L，混合均勻，室溫反應2 h后，在波長734 nm處測定其吸光度值，VC為陽性對照，ABTS+自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為不含樣品吸光度值；A1為含樣品和ABTS+吸光度值；A2為不含ABTS+樣品吸光度值。

（3）還原力的測定

按照VASCO C等[18]文獻，測定樣品FRAP值。取不同質量濃度（0.2～1.0mg/m L）SRP-1和SRP-2各150m L，均加入4.5m LFRAP工作液，在37℃加熱反應40m in，在波長593 nm處測定其吸光度值，根據吸光度值，求得FeSO4相應濃度，定義為FRAP值。

（4）抗氧化能力指數的測定

參照文獻[19]方法測定ORAC值（抗氧化能力指數），ORAC值以Trolox當量（Troloxequivalent，TE）（μmolTE/mg）表示。

3×0+8+3×9+6+3×0+0+3×1+2+3×4+5+3×6=8+27+3+6+2+12+5+18=81，于是在這個加權和的方式下，若想讓UPC的每位數字和被10整除，則校驗碼應為9，即81+9=90被10整除．因此，正確的UPC應是 0 8 9 6 0 0 1 2 4 5 6 9．

1.3.5 數據處理

所有試驗均重復3次，數據以平均值±標準差形式表示；數據采用Origin2016軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 三相萃取單因素試驗

2.1.1 硫酸銨飽和度對黃參蛋白分離效果的影響

蛋白質鹽析效果不僅與鹽的種類有關，而且與鹽的濃度密切相關。硫酸銨飽和度是影響三相萃取體系主要因素之一；不同飽和度條件下三相體系對黃參蛋白質分離具有不同提取效果。固定黃參蛋白粗提液與叔丁醇體積比為1.0∶1.0，改變硫酸銨飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%，研究硫酸銨飽和度對黃參蛋白質三相萃取效果的影響，結果見圖1。

圖1 硫酸銨飽和度對黃參蛋白質三相萃取效果的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate saturation on three phasepartitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

硫酸銨的鹽析作用可有效促進蛋白質發生沉淀作用；NH4+和SO42-由于霍夫密斯特效應在蛋白質、酶等生物大分子的分子間相互作用的兩端具有重要作用。叔丁醇與蛋白質粗提液互溶，一定量硫酸銨加入溶解后，出現明顯分層現象；即上相為叔丁醇相，下相主要含鹽，鹽析作用結果出現中間蛋白質沉淀固體相，形成液-固-液三相體系。由圖1可知，隨著硫酸銨飽和度逐漸增加，黃參蛋白質提取率呈現先增大后減小的趨勢，當飽和度為50%時，提取率達到最大值；與其他梯度下硫酸銨飽和度相比，其提取率差異顯著（P＜0.05）；繼續增加飽和度，蛋白質提取率逐漸下降；原因可能是硫酸銨在低飽和時，硫酸銨與叔丁醇協同效果較弱，導致部分蛋白質停留在下相；當飽和度過高時，可能促使其他雜蛋白被沉淀于中間相，影響其提取效果。因此，確定硫酸銨飽和度為50%。

2.1.2 叔丁醇加入量對黃參蛋白分離效果的影響

叔丁醇與其他醇類有機溶劑相比，是一種獨特一元醇，不僅具有溶解非極性成分外，還有醇沉和浮選劑作用，與一定量硫酸銨協同作用可有效純化目標產物。本試驗中，固定硫酸銨飽和度為50%，改變蛋白質提取液與叔丁醇體積比分別為1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5，分析叔丁醇加入量對黃參蛋白分離效果的影響，結果見圖2。

圖2 叔丁醇加入量對黃參蛋白質三相萃取效果的影響Fig.2 Effect of tert-butanoladdition on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

由圖2可知，當蛋白質提取液和叔丁醇體積比在1.0∶0.5～1.0∶1.0范圍內時，黃參蛋白質提取率逐漸增加，當蛋白質提取液和叔丁醇體積比為1.0∶1.0時，提取率達到最大值，為（86.51±0.21）%；與蛋白質提取液和叔丁醇體積比1.0∶0.5相比，提取率差異顯著（P＜0.05）；當上述二者體積比在1.0∶1.0～1∶2.5內，提取率之間差異均不顯著（P＞0.05）；叔丁醇加入量較小時，其與硫酸銨協同效果較弱，導致黃參蛋白質沉淀效果較差；當叔丁醇加入量過高時，蛋白質提取率趨于穩定，基本不變。因此，從節約成本角度考慮，確定蛋白質提取液和叔丁醇體積比為1.0∶1.0。

2.1.3 體系pH對黃參蛋白分離效果的影響

目標蛋白的帶電情況在一定意義上決定了鹽析作用效果，目標蛋白所帶靜電荷主要是由體系pH決定的，在確定叔丁醇加入量和硫酸銨飽和度基礎上，采用1mol/LHCl或1mol/L NaOH改變體系pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，研究體系pH對黃參蛋白分離效果的影響，結果見圖3。

圖3 體系pH值對黃參蛋白質三相萃取效果的影響Fig.3 Effect of system pH on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

在目標蛋白質等電點與三相體系pH接近時，硫酸銨與目標蛋白質之間的相互作用最小，影響目標蛋白質分離效果。當體系pH大于目標蛋白質等電點時，蛋白質帶有負電荷，主要有富集于三相體系下相趨勢；當體系pH小于目標蛋白質等電點時，蛋白質帶有正電荷，利于蛋白質在中間相形成固相沉淀物；由圖3可知，當體系pH值為4.5時，蛋白質提取率達到最大值，為（87.1±0.119）%；與其他不同體系pH獲得的蛋白提取率進行比較，差異顯著（P＜0.05）；體系pH偏高或偏低，均會影響其提取效果。因此，確定體系pH值為4.5。

2.1.4 萃取溫度對黃參蛋白分離效果的影響

溫度是影響三相萃取目標產物因素之一，研究體系萃取溫度對黃參蛋白分離效果的影響，結果見圖4。由圖4可知，當溫度為25℃時，提取率達到最高，為（87.43±0.136）%；分別與萃取溫度為20℃和30℃蛋白質提取率進行比較，差異顯著（P＜0.05）；繼續增加萃取溫度時，蛋白質提取率基本不變，且差異不顯著（P＞0.05）；原因可能是在較低溫度條件下進行萃取時，會影響目標產物傳質效果，導致三相形成較慢，且目標蛋白質與有機溶劑叔丁醇接觸時間長，會影響蛋白質生物活性；溫度較高時，在提高傳質效果的同時，可能會促使部分蛋白質在固液界面發生溶解，導致中間相目標物質減少，影響其提取效果。因此，確定萃取溫度為25℃。

圖4 萃取溫度對黃參蛋白質三相萃取效果的影響Fig.4 Effectof extraction temperature on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

2.1.5 萃取時間對黃參蛋白分離效果的影響

萃取時間是影響目標成分萃取效果另一因素；其不僅影響目標產物得率，在工業化生產中極大影響著生產成本，研究體系萃取時間對黃參蛋白分離效果的影響，結果見圖5。由圖5可知，萃取時間對黃參蛋白質提取率影響得率差異不顯著（P＞0.05），當萃取時間為15m in后，黃參蛋白質提取率隨萃取時間變化趨勢不明顯。因此，確定萃取時間為15min。

圖5 萃取時間對黃參蛋白質三相萃取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on three phase-partitioning extraction of Sphallerocarpus gracilis protein

2.2 三相萃取條件優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，對硫酸銨飽和度、蛋白質提取液與叔丁醇體積比、體系pH值、萃取溫度進行L9（34）正交試驗設計，正交試驗結果與分析見表1。

表1 三相萃取條件優化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonalexperiments for three phase-partitioning extraction conditions optim ization

由表1可知，各個因素對蛋白質提取率影響大小順序為體系pH值＞硫酸銨飽和度＞蛋白質提取液與叔丁醇體積比＞萃取溫度；獲得三相萃取黃參蛋白質最佳萃取條件為A2B2C2D1，即硫酸銨飽和度為50%，蛋白質提取液和叔丁醇體積比為1.0∶1.0，萃取體系pH值為4.5，萃取溫度為20℃。在此優化條件下，進行3次重復試驗，蛋白質平均提取率為（88.71±0.54）%。由表2可知，硫酸銨飽和度、蛋白質提取液和叔丁醇體積比、體系pH值對蛋白質提取影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonalexperiments results

2.3 三相萃取黃參蛋白與鹽析沉淀效果的比較

將黃參蛋白質提取液分別采用三相萃取和鹽析沉淀，蛋白質提取率分別為（88.71±0.54）%和（76.49±0.70）%。結果表明，三相萃取法要優于硫酸銨沉淀法，經萃取后中間相為固體，不需經過脫鹽處理，操作簡單易得。

2.4 黃參蛋白質體外抗氧化活性測定

將上述兩種方法制備的黃參蛋白質組分SRP-1和SRP-2進行了體外抗氧化研究，分析其DPPH、ABTS+自由基清除率、FRAP值和ORAC指數的影響，結果見圖6。

圖6 黃參蛋白質清除DPPH自由基（a）、ABTS+自由基（b）、鐵還原力（c）及氧自由基吸收能力指數（d）檢測結果Fig.6 Determ ination results of DPPH radical(a),ABTS+radical(b)scavenging activities,ferric reducing activity powers(c)and oxygen radicalabsorbance capacity index(d)of Sphallerocarpus gracilis protein

由圖6a可知，在樣品質量濃度為0.2～1.0mg/m L范圍內，蛋白組分SGP-1、SGP-2和VC對DPPH自由基清除效果呈現濃度依賴性，且蛋白組分SGP-1對DPPH自由基清除能力高于SGP-2；當樣品質量濃度為0.4mg/m L時，蛋白組分SGP-1和SGP-2對DPPH自由基效果分別為（61.25±1.51）%和（51.2±1.40）%；蛋白組分SGP-2對DPPH自由基清除效果均低于陽性對照VC；相反，當質量濃度≥0.6mg/m L之后，蛋白組分SGP-1對DPPH自由基清除效果強于陽性對照VC；可能是由于制備的兩個蛋白質樣品中化學組成差異造成的。

由圖6b可知，蛋白組分SGP-1、SGP-2和VC對ABTS+自由基清除效果隨著質量濃度在0.2～1.0mg/m L范圍內逐漸增加呈現濃度依賴性，且蛋白組分SGP-1、SGP-2對ABTS+自由基清除效果均小于VC；當質量濃度為1mg/m L時，蛋白組分SGP-1和SGP-2具有相似的ABTS+自由基清除效果，清除率分別為（89.2±1.46）%和（89.1±1.39）%；蛋白組分SGP-1質量濃度為0.2mg/m L時，對ABTS+自由基清除率為（55.36±1.32）%；蛋白組分SGP-2質量濃度為0.4mg/m L時，對ABTS+自由基清除率為（59.2±1.26）%；可能是蛋白質樣品中其他成分在一定程度上影響其抗氧化強弱；因此，樣品對ABTS+自由基清除效果不同歸因于樣品中蛋白質及其成分含量差異。

由圖6c可知，不同樣品抗氧化能力強弱呈現濃度依賴性，且均小于陽性對照VC；這種趨勢與圖6b具有顯著相似性；蛋白組分SGP-1具有最大的還原力；當樣品質量濃度為1mg/m L時，蛋白組分SGP-1和SGP-2的FRAP值分別為0.99mmol/L和0.59mmol/L；結果表明，蛋白組分SGP-1具有更強給Fe3+提供電子的能力；蛋白組分SGP-1比SGP-2具有結合Fe3+穩定性更高，其具有更高FRAP值；說明其樣品組成中蛋白質含量多少顯著影響其抗氧化能力。

由圖6d可知，蛋白組分SGP-1和SGP-2兩個樣品ORAC指數分別為（109±1.56）μmolTE/mg和（65±1.42）μmolTE/mg；與蛋白組分SGP-2相比，蛋白組分SGP-1具有顯著的ORAC指數（P＜0.05），其抑制自由基的抗氧化能力就越強。說明兩個樣品均可作為抗氧化劑清除2,2'-鹽酸脒基丙烷（2,2'-azobis（2-amidinopropane）dinydrochloride，AAPH）形 成的自由基；曹亞蘭等[20]報道大豆抗氧化肽與ORAC指數有直接相關性；結合以上數據可推斷，SGP-1和SGP-2的ORAC指數差異主要受兩個樣品中化學成分影響；因此，ORAC指數已成為衡量中藥材或功能食品總抗氧化能力非常重要指標之一。

3結論

本研究采用三相萃取黃參蛋白質，對其萃取條件優化基礎上，并與傳統鹽析沉淀方法進行了比較，表明三相萃取制備的黃參蛋白質具有較高蛋白質提取率；對兩種方法制備的蛋白質分別命名為SGP-1和SGP-2，并對兩個樣品體外抗氧化活性進行比較研究。結果表明，當硫酸銨飽和度為50%，蛋白質提取液和叔丁醇體積比為1.0∶1.0，萃取體系pH值為4.5，萃取溫度為20℃。在此優化條件下，進行3次重復試驗，蛋白質平均提取率為（88.71±0.54）%。蛋白組分SGP-1和SGP-2對DPPH、ABTS自由基最大清除率分別為（61.25±1.51）%、（51.2±1.40）%和（89.2±1.46）%、（89.1±1.39）%；蛋白組分SGP-1和SGP-2的FRAP值、ORAC指數分別為0.99mmol/L、（109±1.56）μmol TE/mg和0.59mmol/L、（65±1.42）μmol TE/mg。兩個樣品在一定質量濃度范圍內抗氧化活性均呈現濃度依賴性；與SGP-2相比，SGP-1具有較高抗氧化活性，可能與樣品中蛋白質含量及其他成分或結構有關，然后，抗氧化性與樣品之間復雜關系受多種因素的影響，后續工作進一步闡明蛋白質抗氧化活性機制，為黃參蛋白質深入研究提供科學依據。