發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸檢測方法的優(yōu)化

胡 貝，李麗霞，李曉健，劉 紅，黃 偉

（湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075）

發(fā)酵豆制品是發(fā)酵食品中的一大類，在亞洲國家人民飲食中占重要地位，其中豆豉、豆醬、醬油和腐乳又被稱為中國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，在我國有深厚的消費基礎(chǔ)[1-2]。隨著發(fā)酵豆制品具有抗氧化、降血壓、降血糖、溶血栓等保健功效被揭示[1，3]，以及人們對食品安全和食品營養(yǎng)的關(guān)注度越來越高，保障發(fā)酵豆制品的安全性顯得越發(fā)重要。

脫氫乙酸是繼苯甲酸鈉、尼泊金和山梨酸鉀后的新一代廣譜型食品防腐劑，對霉菌、酵母菌和細(xì)菌的抑制能力極強[4-5]。但已有毒理學(xué)研究表明，脫氫乙酸會對人體的腎臟、肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生慢性影響，并可能引發(fā)癌癥[6]。目前，國標(biāo)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]中明確規(guī)定了發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的最大使用量為0.3 g/kg。由于發(fā)酵豆制品成分復(fù)雜，運用國標(biāo)方法[8-9]檢測時，前處理方法除雜效果差，色譜分離效果十分不理想，且分析時間長，不利于大批量發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的準(zhǔn)確測定。因此，建立適應(yīng)性更強的檢測方法成為了亟待解決的問題。本實驗從前處理方法（包括蛋白沉淀劑種類、除油脂方法、除鹽方法、提取方法、提取時間、固相萃取小柱種類）和色譜條件（流動相體系）兩方面優(yōu)化了發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測方法，為食品中脫氫乙酸的測定的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的制修訂和日常監(jiān)督檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆醬：某公司；脫氫乙酸（1 000μg/m L）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國默克公司；乙酸銨（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、甲酸、乙酸、氨水（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水。CleanertSC18固相萃取小柱（500mg/6m L）：天津博納艾杰爾科技有限公司；Bond ElutC18固相萃取小柱（500mg/6mL）：美國Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；ST16臺式離心機：德國Thermo FisherScientific公司；LC-250型超聲波清洗器：山東濟寧魯超超聲設(shè)備有限公司；VM 24固相萃取儀：天津博納艾杰爾科技有限公司；M illi-Q純水機：德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：量取適量脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，加水定容至刻度，依次配制成質(zhì)量濃度分別為1.0μg/m L、5.0μg/m L、10.0μg/m L、20.0μg/m L、50.0μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理方法

提取：稱取約5.0 g均勻樣品于50m L塑料離心管中，加入約10m L水，加入0.2m L亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入0.2m L乙酸鋅，搖勻，用氫氧化鈉溶液（20 g/L）調(diào)pH至7.5，加水稀釋至50m L，搖勻。超聲提取20m in（超聲功率250W），8 000 r/min離心10min，上清液待凈化。

凈化富集：取20m L上清液，用10%的甲酸水溶液調(diào)pH至5.0，定容至25m L，取5m L過已活化的C18固相萃取小柱（依次用5m L甲醇，10m L水活化小柱），用5m L水淋洗，2m L體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液2m L，渦旋混勻，過0.45μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate AQ-C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相為甲醇：0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）=2∶98（V/V），流速1.0m L/min；柱溫30 ℃；進樣量10μL；檢測波長為293 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 蛋白沉淀劑及用量的選擇

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)[8-9]、地方標(biāo)準(zhǔn)[10-11]及相關(guān)研究[12-19]中所使用的蛋白沉淀劑，選擇了有機沉淀劑（丙酮）、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、硫酸銅和氫氧化鈉與硫酸鋅共4種蛋白沉淀劑進行對比試驗。稱取12份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0 g），分為4組（每組3個平行樣），加標(biāo)量均為10.0mg/kg，加入蛋白沉淀劑的量分別為丙酮2m L、亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）各2 mL、硫酸銅溶液（100 g/L）和氫氧化鈉溶液（40 g/L）各2m L、硫酸鋅溶液（120 g/L）5mL，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。結(jié)合4種不同沉淀劑的提取效率及沉淀效果，亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）的提取率最高，樣品平均回收率為92.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.1%，沉淀蛋白質(zhì)效果最佳。因此，選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為蛋白沉淀劑。

目前通溝污泥的清淤技術(shù)已較成熟，主要采用機械清淤與人工清淤相結(jié)合的方式，基本都可以達到有效清淤的目的。當(dāng)淤積嚴(yán)重或者管道坡度太小的情況下，通常采用以下方式進行清淤：（1）采用水力沖刷；（2）在檢查井內(nèi)采用抽吸罐車吸取泥/水混合物。

對亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的加入量進行優(yōu)化，稱取33份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0 g），分為11組（每組3個平行樣），加標(biāo)量均為10.0mg/kg，分別加入亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）各0.1mL、0.2m L、0.3m L、0.4m L、0.5m L、1.0m L、1.5m l、2.0m L、3.0m L、4.0m L、5.0m L，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）的添加量對脫氫乙酸的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果的影響如表1所示。由表1可知，亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）各加入0.2mL時提取率最高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.6%。因此，選擇亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）的加入量均為0.2m L進行后續(xù)試驗。

表1 亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液的添加量對脫氫乙酸測定的影響Table 1 Effect of potassium ferrocyanide solution and zinc acetate solution addition on the determ ination of dehydroacetic acid

2.1.2 除油脂方法的選擇

稱取12份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0g），分為4組（每組3個平行樣），加標(biāo)量均為10.0mg/kg，將1.3.2（1）中經(jīng)過超聲提取后的樣液分別采用8 000 r/min離心10min后用注射器吸取上層油脂[20]、依照國標(biāo)方法[8-9]用正己烷萃取油脂除油、8 000 r/min離心10min和4 000 r/min離心10min共4種不同方法進行除油脂，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。結(jié)果表明，8000 r/min離心10min相較于其他3種除油脂方法不僅無需使用有機試劑、且有較好的除油脂效果，操作簡便、省時省力。因此，選擇8000 r/min離心10min作為最適除油脂方法。

2.1.3 提取方法的選擇

稱取9份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0 g），分為3組（每組3個平行樣），加標(biāo)量均為10.0mg/kg，分別采用渦旋、超聲、70℃恒溫水浴加熱提取30m in[21]3種不同的提取方式進行提取，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。結(jié)果表明，3種提取方式的提取效率無顯著性差異，超聲提取的樣品回收率較高且省時省力。因此，選擇超聲提取作為最適提取方法。

2.1.4 提取時間的選擇

稱取12份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0g），分為4組（每組3個平行樣），加標(biāo)量均為10.0mg/kg，設(shè)定超聲提取時間分別為10min、20min、30min、40min，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。不同提取時間對脫氫乙酸的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果的影響如表2所示。結(jié)果表明，20min的提取效果最佳（平均回收率96.2%，RSD為1.9%）。因此，確定最適超聲提取時間為20min。

表2 提取時間對脫氫乙酸測定的影響Table2Effectofextractiontimeondehydroaceticacid determination

由于發(fā)酵豆制品含鹽量高[3]，本實驗選擇了2種固相萃取小柱（分別為BondElutC18柱和CleanertSC18柱）進行除鹽效果對比試驗。BondElutC18柱是強疏水性的鍵合硅膠吸附劑，可用于在離子交換之前去除水相基質(zhì)中的鹽分，鹽能毫無保留地通過吸附劑。CleanertSC18柱是以高純球型硅膠為基質(zhì)的反相C18萃取柱。球型材料均勻度更高，流速更穩(wěn)定，高純的硅膠表面，避免了對堿性與極性物質(zhì)的過度吸附，更適合用于萃取低濃度分析物。可應(yīng)用于樣品的脫鹽、環(huán)境水樣中的有機物的富集等。

對2種固相萃取小柱分別進行低、中、高濃度（加標(biāo)量分別為2.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg）的加標(biāo)回收試驗（每組6個平行樣），按1.3.2處理樣品，脫氫乙酸的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表3。由表3可知，使用BondElutC18柱進行凈化，當(dāng)加標(biāo)量為2.0mg/kg時，脫氫乙酸的平均回收率僅為74.1%，難以對低濃度的脫氫乙酸進行準(zhǔn)確定量。而使用CleanertSC18柱進行凈化，加標(biāo)量為2.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg時，平均回收率均高于BondElutC18柱，RSD為1.3%～2.9%。當(dāng)樣品加標(biāo)量均為5.0mg/kg時，將用國標(biāo)方法GB5009.121—2016《食品中脫氫乙酸的測定》進行前處理、樣品經(jīng)BondElutC18柱凈化、及樣品經(jīng)CleanertSC18柱凈化后的樣品色譜圖進行對比，結(jié)果見圖1。如圖1所示，樣品經(jīng)CleanertSC18柱凈化后雜質(zhì)更少。因此，試驗選擇CleanertSC18柱。

表3 2種固相萃取小柱的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果（n=6）Table3Resultsofaddingstandardrecoverytestof2typesofsolidphaseextractioncolumn(n=6)

圖1 加標(biāo)樣品高效液相色譜圖Fig.1HPLCchromatogramsofaddingstandardsamples

2.2 流動相的選擇

國標(biāo)方法[8-9]中采用甲醇-0.02mol/L乙酸銨體系作為流動相進行發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測時，使用甲醇-0.02mol/L乙酸銨（10∶90，V/V）洗脫樣品溶液，目標(biāo)峰（脫氫乙酸）拖尾，雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰之間常常無法實現(xiàn)分離，甚至在40m in附近還有雜質(zhì)峰被洗出，造成分析時間長、效率低下。因此，本研究根據(jù)文獻報道對比了乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀體系[19-20]、甲醇-0.02mol/L乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.5）體系[16]、甲醇-0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）體系[22]共3種體系作為流動相進行等度洗脫，進行發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)HPLC色譜圖見圖2。由圖2可知，流動相為甲醇∶0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）=2∶98（V/V）時，相較于乙腈∶0.02mol/L磷酸二氫鉀=35∶65（V/V）、甲醇∶0.02mol/L乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.5）=40∶60（V/V）兩種流動相體系，目標(biāo)峰對稱性好，與雜質(zhì)峰分離效果好。因此，選擇甲醇∶0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）=2∶98（V/V）進行洗脫。

圖2 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of dehydroacetic acid standard

2.3 線性范圍及檢出限

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為1.0μg/m L、5.0μg/m L、10.0μg/m L、20.0μg/m L、50.0μg/m L，按1.3.3色譜條件進樣分析，以峰面積（y）和脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of dehydroacetic acid

由圖3可知，該方法在1～50μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=25.084x-0.640，相關(guān)系數(shù)R2為1.000 0，以3倍信噪比計算檢出限，方法檢出限為1.0mg/kg。

2.4 精密度試驗

以質(zhì)量濃度10.0μg/m L的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液連續(xù)重復(fù)進樣6次進行精密度試驗，分別計算脫氫乙酸的含量并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表4。由表4可知，脫氫乙酸的測定結(jié)果的RSD為0.6%，表示該方法精密度良好。

表4 精密度試驗結(jié)果Table 4 Results of precision tests

2.5 加標(biāo)回收率試驗

稱取空白腐乳、豆醬、豆豉、醬油樣品各18份（每份約5.0 g），將每個品種的發(fā)酵豆制品各分為3組（每組6個平行樣），分別添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，使3組樣品中脫氫乙酸的加標(biāo)量分別為2.0mg/kg（低）、5.0mg/kg（中）和10.0mg/kg（高）三個水平，按1.3.2處理樣品進行回收實驗，樣品加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表5。由表5可知，該方法平均回收率為81.7%～99.1%，RSD為0.6%～2.7%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表5 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 5 Results of adding standard recovery tests

3 結(jié)論

本試驗對發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測方法的前處理條件及色譜條件進行了優(yōu)化，建立了一種固相萃取-高效液相色譜測定發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的方法，有效的解決了發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的高效凈化富集、液相色譜條件的優(yōu)化、準(zhǔn)確定性定量的三大關(guān)鍵問題。該方法在1～50μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，方法檢出限為1.0mg/kg，精密度試驗結(jié)果RSD為0.6%，加標(biāo)回收率為81.7%～99.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.6%～2.7%。該方法相較于現(xiàn)行國標(biāo)方法，靈敏度更高、除雜效果明顯，且回收率和重現(xiàn)性良好。不僅有利于延長色譜柱及高效液相色譜儀的使用壽命，還可以為食品中脫氫乙酸測定的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的制修訂和日常監(jiān)督檢測提供科學(xué)依據(jù)。