植物乳桿菌與乳酸聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵工藝的研究

李越　王自強(qiáng)　王云山　張萬(wàn)忠　蘇志國(guó)

摘要：以?xún)?yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌的發(fā)酵液進(jìn)行回用實(shí)驗(yàn)，采用搖瓶與7L發(fā)酵罐對(duì)發(fā)酵工藝過(guò)程中各階段活菌數(shù)與乳酸的濃度變化進(jìn)行了初步研究。在搖瓶階段對(duì)植物乳桿菌與乳酸聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的可行性進(jìn)行驗(yàn)證，并在7L發(fā)酵罐上進(jìn)行應(yīng)用性嘗試。研究結(jié)果表明：通過(guò)回用植物乳桿菌的發(fā)酵液能夠使乳酸最終產(chǎn)量達(dá)到150g/L。在7L發(fā)酵罐規(guī)模下，發(fā)酵終點(diǎn)活菌數(shù)累積量達(dá)到259×108CFU/ml

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌;乳酸;聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵;廢液回用

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬乳桿菌屬，屬于同型發(fā)酵乳酸菌，是目前最常用的益生菌之一。廣泛應(yīng)用于青貯飼料的制作與益生菌劑的生產(chǎn)中，并且取得了良好效果【1-3】。隨著人們研究的不斷深入，植物乳桿菌已成為乳酸菌研究領(lǐng)域的模式菌種，并有人將其形象地稱(chēng)為“自然代謝工程師”【4】。在植物乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中能夠利用糖類(lèi)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸細(xì)菌【5】，乳酸作為21世紀(jì)最具應(yīng)用潛力的有機(jī)酸之一【6】。廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)，同時(shí)乳酸還可作為防腐劑、酸味劑等應(yīng)用于其他行業(yè)【7-8】。在乳酸生產(chǎn)方面，呂樂(lè)等【9】人通過(guò)改變?nèi)樗峋l(fā)酵條件篩選出—株高產(chǎn)乳酸的乳酸菌USTB-08，通過(guò)pH值控制得到了最高的乳酸產(chǎn)量為30g/L。

植物乳桿菌用于益生菌劑生產(chǎn)時(shí)，主要采用分批發(fā)酵方式。發(fā)酵培養(yǎng)基中K+和Mg2+這些無(wú)機(jī)元素在發(fā)酵過(guò)程中主要起到調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、作為酶的組成成分或維持酶的活性等作用【10】，只有極少部分被菌體吸收，大量地將發(fā)酵液排放至大自然中，不僅浪費(fèi)，還會(huì)造成環(huán)境的污染。而植物乳桿菌代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定濃度的乳酸【11】，隨著發(fā)酵液回用次數(shù)的增加，乳酸產(chǎn)量也在不斷增加。因此，本研究期望對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液的回用來(lái)減少?gòu)U水排放，并達(dá)到節(jié)能環(huán)保的目的，且在一定程度上降低了生產(chǎn)成本。同時(shí)實(shí)現(xiàn)植物乳桿菌與乳酸的高密度聯(lián)產(chǎn)，為其他益生菌發(fā)酵提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1 1 1實(shí)驗(yàn)試劑植物乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）由本實(shí)驗(yàn)室保藏;玉米漿、酵母粉由山東鄒平鶴伴山生物科技有限公司提供;磷酸氫二甲，硫酸鎂，硫酸錳，檸檬酸銨、葡萄糖、氨水、濃硫酸由北京北化精細(xì)化學(xué)品公司提供。

1 1 2實(shí)驗(yàn)儀器Bio- Rad譜柱：美國(guó)Beckman公司;Sartorius ar-ium 611UF型純水機(jī)：德國(guó)Sartorius公司;7200型分光光度計(jì)：上海尤尼克公司;2695型HPLC：美國(guó)Waters公司;DELTA320pH計(jì)、電子天平：METTLER TOLEDO：LDZX-4081立式蒸汽壓力滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠;SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱：黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司;XL-90型大容量離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司;5L全自動(dòng)攪拌式發(fā)酵罐：上海百侖生物科技有限公司;高效液相色譜LC-20AT：日本島津公司。

1.1 3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基（ MRS）【12】：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，酵母粉lOg/L，磷酸氫二甲2g/L，無(wú)水乙酸鈉5g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.05g/L，檸檬酸銨2g/L，吐溫80lml/L，調(diào)pH至6.5 - 6.8，于121。C滅菌30min。

發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖20，玉米漿30，酵母粉5，磷酸氫二甲2，硫酸鎂0 2，硫酸錳0 05，檸檬酸銨2，調(diào)pH值至6.5 -6.8，于1210C滅菌30min。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1 2 1培養(yǎng)方法活化培養(yǎng)：將保藏在- 60℃甘油管中的菌種少量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)12h后，將菌液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30h，挑單菌落進(jìn)行劃線，繼續(xù)在MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)皿培養(yǎng)24h后，置于-4℃冰箱中保藏備用。

1 2 2種子與發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)，裝液量lOOml，挑取培養(yǎng)皿中單菌落無(wú)菌接人種子培養(yǎng)基中，于370C恒溫培養(yǎng)12h。以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔2h檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況，發(fā)酵結(jié)束后。進(jìn)行計(jì)數(shù)培養(yǎng)，之后離心收集發(fā)酵廢液，為下次實(shí)驗(yàn)備用。

7L發(fā)酵罐，裝液量4.8L，將保存在培養(yǎng)皿中的單菌落挑人種子培養(yǎng)基中，370C，50r/min培養(yǎng)12h。將200mL種子液接種到4.8L優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，370C繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程中攪拌速度改為lOOr/min以使溶質(zhì)得到充分的混合，用氨水調(diào)控發(fā)酵液的pH值，將其控制在6 5左右。發(fā)酵期間通過(guò)補(bǔ)加600g/L高濃度的葡萄糖溶液控制底物濃度，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程定時(shí)取樣分析發(fā)酵液的細(xì)胞生物量。每次發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行計(jì)數(shù)培養(yǎng)，之后離心收集發(fā)酵廢液，為下次實(shí)驗(yàn)備用。

1 2 3發(fā)酵液回收利用方法向離心后廢液中補(bǔ)加葡萄糖至20g/L【13】，再向其中補(bǔ)加30g/L的玉米漿，于1210C滅菌30min，以相同接種量及裝液量重新進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后做活菌計(jì)數(shù)，并測(cè)量發(fā)酵終點(diǎn)乳酸濃度。按上述方法不斷回用發(fā)酵廢液，直至最后批次發(fā)酵無(wú)菌體產(chǎn)生，且乳酸濃度不再變化。

1 2 4發(fā)酵參數(shù)測(cè)定通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液在600nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)菌體生物量。將待測(cè)發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使OD600=0.3-0.8，采用UNIC7200分光光度計(jì)測(cè)定。

乳酸含量測(cè)定采用高效液相色譜法（HPLC）。

樣品處理：精密量取發(fā)酵上清液ImL，用超純水定容至5mL，得到乳酸的稀釋待測(cè)液。測(cè)定時(shí)樣品經(jīng)0.22um微孔濾膜過(guò)濾。

色譜條件：色譜條件：流動(dòng)相為0 005mol/L H2S04，流速0.4mL/min，柱溫550C，進(jìn)樣量lOuLc141。

2結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵液的多次回用（搖瓶）

采用搖瓶培養(yǎng)新鮮發(fā)酵液，再依次按照1 2 3的方法進(jìn)行發(fā)酵液的多次回用，當(dāng)發(fā)酵液重復(fù)使用至第六批次時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)無(wú)菌體產(chǎn)生，且乳酸濃度沒(méi)有任何變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1與圖1。

結(jié)果表明：新鮮發(fā)酵液的活菌數(shù)為72 xlOaCFU/ml，乳酸產(chǎn)量為35g/L。伴隨發(fā)酵液回用次數(shù)的增加，菌體生長(zhǎng)的延遲期逐漸變長(zhǎng)，繼而造成發(fā)酵周期延長(zhǎng)。新鮮發(fā)酵液發(fā)酵過(guò)程中，OD600的增長(zhǎng)值為最大值8，活菌數(shù)最高，乳酸產(chǎn)量相對(duì)較高。當(dāng)發(fā)酵廢液重復(fù)使用至第四批次時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)OD600增長(zhǎng)值維持在5左右，而在發(fā)酵廢液重復(fù)使用的過(guò)程中，發(fā)酵

圖1發(fā)酵液回用過(guò)程中各批次生物量變化液每重復(fù)使用一次，發(fā)酵終點(diǎn)的活菌數(shù)依次降低，直至最后批次發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有任何菌體產(chǎn)生。發(fā)酵廢液重復(fù)使用一次時(shí)，乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大，此代謝過(guò)程中乳酸產(chǎn)量為43g/L。發(fā)酵廢液重復(fù)使用第三次時(shí)，菌體乳酸代謝能力依次下降，當(dāng)?shù)谖迮螌?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，廢液中乳酸濃度達(dá)到最大值，為148g/L。此時(shí)各批次實(shí)驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)總量為184×108CFU/ml。

2.2發(fā)酵液的多次回用（7L發(fā)酵罐）

表2 2各組回用實(shí)驗(yàn)發(fā)酵終點(diǎn)參數(shù)對(duì)比

在上述搖瓶實(shí)驗(yàn)階段中，根據(jù)不同批次廢液生產(chǎn)乳酸及發(fā)酵終點(diǎn)活菌數(shù)的生產(chǎn)情況，現(xiàn)進(jìn)行7L發(fā)酵罐小試實(shí)驗(yàn)，新鮮發(fā)酵液發(fā)酵結(jié)束后，按照1 2 3中的試驗(yàn)方法進(jìn)行發(fā)酵液回用實(shí)驗(yàn)。

7L發(fā)酵罐滅菌過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多余的蒸餾水，使發(fā)酵液回用時(shí)的初始乳酸濃度降低。各批次回用實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2及圖2。

結(jié)果表明，在分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液回用后發(fā)酵延遲期增加，導(dǎo)致發(fā)周期變長(zhǎng)，新鮮發(fā)酵液O D00的增長(zhǎng)值為最大值19，活菌數(shù)最高為123×108CFU/ml，乳酸產(chǎn)量為65g/L。當(dāng)發(fā)酵廢液重復(fù)使用至第三批次時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)0 Deoo增長(zhǎng)值維持在5左右，而在發(fā)酵廢液重復(fù)使用的過(guò)程中，發(fā)酵液每重復(fù)使用一次，發(fā)酵終點(diǎn)的活菌數(shù)依次降低，直至最后批次發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有任何菌體產(chǎn)生。發(fā)酵廢液重復(fù)使用第二次時(shí)，菌體乳酸代謝能力依次下降，直至廢液重復(fù)使用至第四批次時(shí)，乳酸含量沒(méi)有任何變化，此時(shí)發(fā)酵終點(diǎn)累積的乳酸濃度為150g/L。發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的總產(chǎn)量為259×108CFU/ml。

3結(jié)論

搖瓶實(shí)驗(yàn)表明，植物乳桿菌發(fā)酵液多次回用后，乳酸產(chǎn)量最終達(dá)到148g/L，乳酸產(chǎn)量較新鮮發(fā)酵液相比增加3 3倍，活菌數(shù)數(shù)累積量與新鮮發(fā)酵液相比增加1 5倍。而在7L罐規(guī)模發(fā)酵下，植物乳桿菌活菌數(shù)累積為259 X108CFU/ml，較新鮮發(fā)酵液相比增加1倍左右，乳酸產(chǎn)量達(dá)到150g/L。由此可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵液的回用提高了菌體及乳酸的產(chǎn)量，并減少了發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的使用量，同時(shí)減少了發(fā)酵廢水的排放。

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