植物乳桿菌與乳酸聯產發酵工藝的研究

李越　王自強　王云山　張萬忠　蘇志國

摘要：以優化后的發酵培養基對植物乳桿菌的發酵液進行回用實驗，采用搖瓶與7L發酵罐對發酵工藝過程中各階段活菌數與乳酸的濃度變化進行了初步研究。在搖瓶階段對植物乳桿菌與乳酸聯產發酵的可行性進行驗證，并在7L發酵罐上進行應用性嘗試。研究結果表明：通過回用植物乳桿菌的發酵液能夠使乳酸最終產量達到150g/L。在7L發酵罐規模下，發酵終點活菌數累積量達到259×108CFU/ml

關鍵詞：植物乳桿菌;乳酸;聯產發酵;廢液回用

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬乳桿菌屬，屬于同型發酵乳酸菌，是目前最常用的益生菌之一。廣泛應用于青貯飼料的制作與益生菌劑的生產中，并且取得了良好效果【1-3】。隨著人們研究的不斷深入，植物乳桿菌已成為乳酸菌研究領域的模式菌種，并有人將其形象地稱為“自然代謝工程師”【4】。在植物乳桿菌發酵過程中能夠利用糖類發酵生產乳酸細菌【5】，乳酸作為21世紀最具應用潛力的有機酸之一【6】。廣泛應用于食品行業及醫藥行業，同時乳酸還可作為防腐劑、酸味劑等應用于其他行業【7-8】。在乳酸生產方面，呂樂等【9】人通過改變乳酸菌發酵條件篩選出—株高產乳酸的乳酸菌USTB-08，通過pH值控制得到了最高的乳酸產量為30g/L。

植物乳桿菌用于益生菌劑生產時，主要采用分批發酵方式。發酵培養基中K+和Mg2+這些無機元素在發酵過程中主要起到調節細胞滲透壓、作為酶的組成成分或維持酶的活性等作用【10】，只有極少部分被菌體吸收，大量地將發酵液排放至大自然中，不僅浪費，還會造成環境的污染。而植物乳桿菌代謝過程中會產生一定濃度的乳酸【11】，隨著發酵液回用次數的增加，乳酸產量也在不斷增加。因此，本研究期望對植物乳桿菌發酵液的回用來減少廢水排放，并達到節能環保的目的，且在一定程度上降低了生產成本。同時實現植物乳桿菌與乳酸的高密度聯產，為其他益生菌發酵提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1 1 1實驗試劑植物乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）由本實驗室保藏;玉米漿、酵母粉由山東鄒平鶴伴山生物科技有限公司提供;磷酸氫二甲，硫酸鎂，硫酸錳，檸檬酸銨、葡萄糖、氨水、濃硫酸由北京北化精細化學品公司提供。

1 1 2實驗儀器Bio- Rad譜柱：美國Beckman公司;Sartorius ar-ium 611UF型純水機：德國Sartorius公司;7200型分光光度計：上海尤尼克公司;2695型HPLC：美國Waters公司;DELTA320pH計、電子天平：METTLER TOLEDO：LDZX-4081立式蒸汽壓力滅菌器：上海申安醫療器械廠;SKP-01電熱恒溫培養箱：黃石恒豐醫療器械有限公司;XL-90型大容量離心機：美國Beckman公司;5L全自動攪拌式發酵罐：上海百侖生物科技有限公司;高效液相色譜LC-20AT：日本島津公司。

1.1 3培養基種子培養基（ MRS）【12】：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏lOg/L，酵母粉lOg/L，磷酸氫二甲2g/L，無水乙酸鈉5g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.05g/L，檸檬酸銨2g/L，吐溫80lml/L，調pH至6.5 - 6.8，于121。C滅菌30min。

發酵優化培養基：葡萄糖20，玉米漿30，酵母粉5，磷酸氫二甲2，硫酸鎂0 2，硫酸錳0 05，檸檬酸銨2，調pH值至6.5 -6.8，于1210C滅菌30min。

1.2實驗方法

1 2 1培養方法活化培養：將保藏在- 60℃甘油管中的菌種少量接種于MRS液體培養基中，于37℃靜置培養12h后，將菌液均勻涂布于MRS固體培養基中繼續培養30h，挑單菌落進行劃線，繼續在MRS固體培養基中培養，將培養皿培養24h后，置于-4℃冰箱中保藏備用。

1 2 2種子與發酵培養搖瓶培養，裝液量lOOml，挑取培養皿中單菌落無菌接人種子培養基中，于370C恒溫培養12h。以5%的接種量接入發酵培養基中，每隔2h檢測菌體生長情況，發酵結束后。進行計數培養，之后離心收集發酵廢液，為下次實驗備用。

7L發酵罐，裝液量4.8L，將保存在培養皿中的單菌落挑人種子培養基中，370C，50r/min培養12h。將200mL種子液接種到4.8L優化后的發酵培養基的7L發酵罐中，370C繼續培養，發酵過程中攪拌速度改為lOOr/min以使溶質得到充分的混合，用氨水調控發酵液的pH值，將其控制在6 5左右。發酵期間通過補加600g/L高濃度的葡萄糖溶液控制底物濃度，整個發酵過程定時取樣分析發酵液的細胞生物量。每次發酵結束后，進行計數培養，之后離心收集發酵廢液，為下次實驗備用。

1 2 3發酵液回收利用方法向離心后廢液中補加葡萄糖至20g/L【13】，再向其中補加30g/L的玉米漿，于1210C滅菌30min，以相同接種量及裝液量重新進行發酵培養，培養后做活菌計數，并測量發酵終點乳酸濃度。按上述方法不斷回用發酵廢液，直至最后批次發酵無菌體產生，且乳酸濃度不再變化。

1 2 4發酵參數測定通過測定發酵液在600nm處的吸光度來檢測菌體生物量。將待測發酵液稀釋適當倍數，使OD600=0.3-0.8，采用UNIC7200分光光度計測定。

乳酸含量測定采用高效液相色譜法（HPLC）。

樣品處理：精密量取發酵上清液ImL，用超純水定容至5mL，得到乳酸的稀釋待測液。測定時樣品經0.22um微孔濾膜過濾。

色譜條件：色譜條件：流動相為0 005mol/L H2S04，流速0.4mL/min，柱溫550C，進樣量lOuLc141。

2結果與討論

2.1發酵液的多次回用（搖瓶）

采用搖瓶培養新鮮發酵液，再依次按照1 2 3的方法進行發酵液的多次回用，當發酵液重復使用至第六批次時，發酵終點無菌體產生，且乳酸濃度沒有任何變化，實驗結果見表1與圖1。

結果表明：新鮮發酵液的活菌數為72 xlOaCFU/ml，乳酸產量為35g/L。伴隨發酵液回用次數的增加，菌體生長的延遲期逐漸變長，繼而造成發酵周期延長。新鮮發酵液發酵過程中，OD600的增長值為最大值8，活菌數最高，乳酸產量相對較高。當發酵廢液重復使用至第四批次時，發酵終點OD600增長值維持在5左右，而在發酵廢液重復使用的過程中，發酵

圖1發酵液回用過程中各批次生物量變化液每重復使用一次，發酵終點的活菌數依次降低，直至最后批次發酵過程中沒有任何菌體產生。發酵廢液重復使用一次時，乳酸產量達到最大，此代謝過程中乳酸產量為43g/L。發酵廢液重復使用第三次時，菌體乳酸代謝能力依次下降，當第五批次實驗結束時，廢液中乳酸濃度達到最大值，為148g/L。此時各批次實驗活菌計數總量為184×108CFU/ml。

2.2發酵液的多次回用（7L發酵罐）

表2 2各組回用實驗發酵終點參數對比

在上述搖瓶實驗階段中，根據不同批次廢液生產乳酸及發酵終點活菌數的生產情況，現進行7L發酵罐小試實驗，新鮮發酵液發酵結束后，按照1 2 3中的試驗方法進行發酵液回用實驗。

7L發酵罐滅菌過程中會產生多余的蒸餾水，使發酵液回用時的初始乳酸濃度降低。各批次回用實驗結果如表2及圖2。

結果表明，在分批補料發酵過程中，發酵液回用后發酵延遲期增加，導致發周期變長，新鮮發酵液O D00的增長值為最大值19，活菌數最高為123×108CFU/ml，乳酸產量為65g/L。當發酵廢液重復使用至第三批次時，發酵終點0 Deoo增長值維持在5左右，而在發酵廢液重復使用的過程中，發酵液每重復使用一次，發酵終點的活菌數依次降低，直至最后批次發酵過程中沒有任何菌體產生。發酵廢液重復使用第二次時，菌體乳酸代謝能力依次下降，直至廢液重復使用至第四批次時，乳酸含量沒有任何變化，此時發酵終點累積的乳酸濃度為150g/L。發酵過程中活菌數的總產量為259×108CFU/ml。

3結論

搖瓶實驗表明，植物乳桿菌發酵液多次回用后，乳酸產量最終達到148g/L，乳酸產量較新鮮發酵液相比增加3 3倍，活菌數數累積量與新鮮發酵液相比增加1 5倍。而在7L罐規模發酵下，植物乳桿菌活菌數累積為259 X108CFU/ml，較新鮮發酵液相比增加1倍左右，乳酸產量達到150g/L。由此可見，通過對植物乳桿菌發酵液的回用提高了菌體及乳酸的產量，并減少了發酵培養基中無機鹽的使用量，同時減少了發酵廢水的排放。

參考文獻

【1】徐志遠乳桿菌的腸道定殖和菌群調節作用研究[D]江蘇：江南大學，2011

【2】曲冬梅，劉小杰植物乳桿菌及其在食品工業中的應用【J】中國食品添加劑2005，3，219-222

【3】馮麗莉，張棟，荀一萍，薛玉玲，王世杰，朱宏植物乳桿菌的功能性及工業化應用研究進展【J】中國乳品工業，2018，36（03）：35-38

【4】SIEZEN R J，van HYLCKAMA VLIEG J E Genomicdiversity and versatility of Lactobacillus plantarum， a naturalmetabolic engineer【J】Microbial Cell Factories， 2011， 10（01）： S3DOI：10 .1186/1475 -2859-10-S1

【5】Kang B Microecology. Dalian： Dalian Press， 1994（康白微生態學大連：大連出版社，1994）

【6】丁涓，魏敏，張莉玉米漿發酵生產L一乳酸的工藝優化【J】食品科學，2011，32（1）：127 -130

【7】江楊娟，徐麗，陳美思，周小敏，韓翠萍，王松乳酸菌發酵大豆糖蜜生產乳酸及糖代謝變化【J】食品科學.2018，39（06）：130- 134

【8】周穎，高曉峰，霍貴成發酵法生產乳酸的研究進展【J】食品工業，2015，36（ 04）：240 - 246

【9】呂樂，張可毅，趙鵬等乳酸菌USTB-08的高效培養和生產乳酸【J】北京科技大學學報，2012，32（ 05）：603 -609

【10】陳堅，堵國成發酵工程原理與技術[M】北京：化學工業出版社，2012

【11】許宏賢，張曉萍，段鋼益生菌乳酸發酵提高低聚果糖含量生產的新方法中國釀造.2016（ 06）：143 -145

【12】Corry J E L，Curtis G D W， Baird R M. Handbook ofCulture Media for Food Microbiology （2 ed.）【M】ElsevierScienceLtd.2003

【13】黃皓，胡珊，羅華建等副干酪乳桿菌發酵廢液的重復利用【J】食品與發酵工業，2013，39（ 03）：97 -101

【14】陳喚蛟，李小連，李彥良等丙酸高產菌株的選育及發酵培養基優化【J】過程工程學報.2014，14（ 03）：482- 486