玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b基因的克隆、表達及亞細胞定位分析

蔡云婷，賈 力，拓昊苑

(四川農業大學 玉米研究所，農業部西南玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，四川 成都 611130)

開花時間是作物最重要的農藝性狀之一[1]。開花對植物授粉、種子發育和形態、籽粒產量、易馴化程度以及環境適應性等方面會產生重要影響。對植物開花時間的調控是植物繁殖的核心問題[2]。在特定的時間開花是植物由營養生長轉變為生殖生長的關鍵步驟，是植物生殖產生后代的重要節點[3]。植物開花受多種內源和外源因素的調節[4]。近些年，通過對模式植物擬南芥突變體的研究，在調控植物開花的途徑中已經發現了很多個重要的基因[5-10]。其中，光周期途徑(Photoperiod pathway)是調節植物開花的四大重要途徑之一[11]。擬南芥光周期開花調節途徑中，光受體接收光照時間長度、強度等光信號，并將信號傳遞給生物節律鐘[12]。根據光受體吸收光譜成分的不同可將其分為三類，即光敏色素(Phytochromes)、隱花色素(Cryptochromes)和向光蛋白(Phototropin)[12]。光敏色素包含五類，即phyA(phytochrome A)、phyB(phytochrome B)、phyC(phytochrome C)、phyD(phytochrome D)和phyE(phytochrome E)。光敏色素主要吸收紅光(Red light，R)和遠紅光(Far-Red light，FR)，前者抑制擬南芥花朵的開放，而遠紅光則作用相反[13]。在遠紅光條件下，phyA會抑制開花抑制因子的生成進而促使植物開花[14]。然而，相同條件下phyb突變體則提早開花，這說明phyB抑制開花，但也有研究表明phyB過量表達會促進植物開花[15]。另外，phyC的功能實現也與phyB的活化相關[16]。隱花色素有兩類，Cry1(Cryptochromes 1)和Cry2(Cryptochromes 2)，主要感知可見光中的藍光[17]。Cry1與Cry12和phyA介導藍光條件下植物的去黃化，促進開花[18]。向光蛋白包含Phot1(Phototropin 1)和Phot2(Phototropin 2)，主要表現在影響植物對藍光依賴的向光性反應[19]，會對葉綠體的運動和植物氣孔的開閉產生影響[20]，另外，向光蛋白自身并不直接參與植物開花過程的調控，對開花時間不會產生影響。

光周期途徑中，當植物體感受到光刺激時會產生規律的自我調節，而這一內在節律性被稱為生物鐘，又叫生理鐘、晝夜節律鐘。大多數真核生物的生理過程都是受生物鐘的調控[21]。與此同時，由生物鐘控制的許多輸出路徑會對生物鐘產生負反饋，導致時鐘變為復雜監管網絡中的中心樞紐。植物的一些生理現象，例如葉片運動、氣孔開閉、CO2的固定等均受到生物鐘的調控，因此能夠觀察到植物的晝夜規律[22]。生物鐘通常被分為3個部分[23-24]：①輸入途徑：使生物鐘機制與晝夜、溫度循環同步，能夠向中心振蕩子傳送光信號或者溫度信號，使中央振蕩子與光暗循環保持相同的機制；②中心振蕩子：是生物鐘的核心組成部分，控制24 h的晝夜節律；③輸出系統：受中心振蕩子控制，由許多生化途徑和發育途徑組成。光信號將節律信號通過中央振蕩器的波動傳輸給下游調節基因，參與下游成花誘導與花發育基因的表達調控。GIGANTEA(GI)是節律輸出的通道基因，GI轉錄物的含量受節律鐘的調控，在清晨時轉錄水平處于最低點，之后持續上升，在大約9 h后達到最高點。GI是控制植物開花的重要基因CO的上游基因，其與ELF3和FKF1共同作用，可以調控CO和FT的轉錄翻譯進而促進開花[25-26]。通過植物本身對生物鐘和光信號的處理，將這2種信號結合起來，進而保證CO(CONSTANS)基因的轉錄及翻譯的穩定性[27]。CO(CONSTANS)是在擬南芥中發現的第一個由節律調控并且會對擬南芥開花產生影響的基因。中央振蕩器是生物鐘的最關鍵的部分，輸入生物節律鐘的光信號在中央振蕩器中產生節律并向下游通路傳遞晝夜節律信號。中央振蕩器主要由2個MYB類蛋白基因LHY(Late elongated hypocotyl)、CCA1(Circadian clock associated1)組成的具有自主調控機制的負反饋環和一種擬南芥偽應答調節蛋白基因家族APRRs(Arabidopsis pseudo-response regulators)組成[28]。

TOC1(Timing of CAB expression 1)又叫APRR1或PRR1，是PRR家族主要成員之一[29]。APRRs小家族有5個成員，包括APRR1/TOC1、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9，并且其余4個基因的轉錄水平和翻譯水平與TOC1類似，都表現出晝夜節律變化。與PRR家族其他成員結構類似，TOC1的N端存在PR結構域(Pseudoreceiver domain)，C端存在CCT結構域(CONSTANS(CO)， CO-like， TOC1)， 但與PRR5、PRR7和PRR9不同的是，TOC1基因不存在IR區域(Intermediate region)[29]。TOC1主要負責中央振蕩器中的調節。中央振蕩器核心的負反饋環由Alabadí等[30]在2001年發現。Alabadí等[30]針對cca1、lhy以及TOC1過表達的擬南芥植株證明，在夜晚TOC1基因表達量升高，進而刺激CCA1/LHY表達量的升高，緊接著CCA1/LHY的積累會反饋抑制TOC1基因的表達,這就是中央振蕩器中核心的負反饋環。

隨后，Nakamichi等[31]發現了中央振蕩器在早晨也會形成一個由CCA1/LHY與PRR9/PRR7構成的負反饋環。2006年，Locke等[32]依據試驗構建出了一個完整的中央振蕩器的反饋模型。TOC1在早晨的表達量達到最高值，緊接著CCA1/LHY與TOC1啟動子區域的夜晚元件EE(EE-element，AAATATCT)相結合，使TOC1的轉錄被抑制。當CCA1/LHY表達量最大時，CCA1/LHY啟動子區域的順式作用元件(TOC1 morning element，T1ME)會與TOC1的CCT結構域結合進而抑制CCA1/LHY表達[33]。

生物鐘與開花調節的信號網絡緊密相連，這也就使得植物開花調節機制變得更為復雜。轉錄因子TOC1(Timing of CAB expression 1)是植物生物鐘的基本組成成分，之前在擬南芥的研究中表明，AtTOC1會對LHY/CCA1的表達有促進作用，也與ZTL、FKF1、ABA等基因產生互作。可是，在玉米中對TOC1的研究并不深入，并且TOC1在玉米中存在2個同源基因，因此，研究TOC1在玉米中的作用也更為必要。本研究通過擬南芥AtTOC1基因的氨基酸序列得到2個在玉米內的同源基因ZmTOC1a及ZmTOC1b，克隆獲得了這2個基因的開放閱讀框的序列，并對目的基因編碼蛋白的特性和表達進行了分析，初步了解了ZmTOC1a和ZmTOC1b的表達模式。對植物光周期的調控因子的研究和進一步深入挖掘，不僅有利于加深對植物花發育過程生物學機理的了解，而且有利于利用熱帶、亞熱帶玉米種質資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所需玉米材料B73由四川農業大學玉米研究所提供。DNA Marker、大腸桿菌感受態購自北京全式金生物技術有限公司；KOD 購自 TaKaRa 公司；限制性內切酶KpnⅠ、XbaⅠ購買于NEB公司；Plasmid Extraction Kit、Gel Extraction Kit 購自 Omega 公司；SuperScript?Ⅱ Reverse Transcriptase Kit 購自 Invitrogen 公司；RNase Free 的槍頭購自 Axygen 公司；卡那霉素、氨芐青霉素、利福霉素、乙酰丁香酮等購自 Biotopped 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 將玉米種子放在有充足蒸餾水的濾紙上28 ℃催芽3 d，種植在營養土中培養至三葉一心時，挑選長勢正常的植株。取幼嫩的玉米葉片 2 g 剪碎放入液氮預冷的研缽，加入適量液氮，迅速研磨直至葉片變為粉末后，將樣本轉入1.5 mL離心管中。按照RNA試劑盒提取說明書，提取總 RNA。使用濃度為1.5%的瓊脂糖對樣品進行條帶完整性檢測，并結合核酸蛋白儀檢測RNA樣品濃度和純度。將電泳圖中條帶清晰、儀器檢測濃度合適的樣品，使用SuperScript?Ⅱ Reverse Transcriptase Kit 反轉錄為cDNA。

1.2.2 候選基因同源克隆 采用GenBank數據庫中擬南芥AtTOC1(AT5G61380)的氨基酸序列，在玉米數據庫MaizeGDB中Blast同源搜索到玉米TOC1基因。在UTR區域設計特異性引物TOC1a-F/R、TOC1b-F/R(表1)，以基因組cDNA作為模板，使用KOD高保真酶進行基因CDS全長序列的擴增。擴增完成后，連接pEASY-BLUNT載體，進行測序。將測序正確的菌液提取質粒并保存于-80 ℃。

表1 ZmTOC1a和ZmTOC1b基因擴增引物信息Tab.1 Information list of ZmTOC1a/ZmTOC1b amplification primer

1.2.3 亞細胞定位分析

1.2.3.1 構建表達載體 根據ZmTOC1a/ZmTOC1b在Maize GDB上的序列信息，設計去除終止密碼子的CDS區域的擴增引物，并在引物兩端分別加上合適的同源臂序列。以保存的質粒為模板，使用帶有同源臂的引物擴增基因完整的開放閱讀框。將表達載體pCAMBIA2300-35S-eGFP使用限制性內切酶KpnⅠ及XbaⅠ線性化。而后使用ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit(南京，諾唯贊)將線性化載體與PCR產物連接并轉化大腸桿菌感受態。挑取單克隆，進行PCR檢測后，將陽性菌落進行質粒提取及測序。在測序結果比對正確后，將陽性單克隆的質粒轉化農桿菌GV3101，從而構建目的基因與eGFP融合的過量表達載體: pCAMBIA2300-35S:ZmTOC1a-eGFP,pCAMBIA2300-35S:ZmTOC1b-eGFP。

1.2.3.2 農桿菌注射煙草 將含重組質粒的農桿菌100 μL加入至含有卡那霉素以及利福平(質量濃度均為50 mg/L)的YEB液體培養基中，28 ℃過夜振蕩培養至生長對數期(OD600約等于0.6)，4 000 r/min離心8 min收集菌體倒掉上清液。而后，使用無菌水(含有終濃度為 10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L MES(pH值5.7)和100 μmol/L乙酰丁香酮)重懸菌體，使菌液濃度達到OD600≈1.0；選取葉齡在5周左右的本氏煙草，用1 mL注射器(去掉針頭)在葉片背部注射菌液直至葉片組織空隙被液體填滿;而后將注射后的煙草放置于25 ℃條件下培養，48 h后用共聚焦顯微鏡觀察注射葉片。

1.2.4 蛋白特性分析及基因進化樹構建 使用DNAMAN將目的基因的序列進行翻譯；使用Prot PARAM對基因表達蛋白進行理化性質分析；使用NetPhos 3.1 Server對蛋白質磷酸化位點預測；使用MEGA 5.0 構建基因進化樹， 進化樹構建方法采用MEGA 軟件的NJ 法(Neighbor Joining Method)， Bootstrap 值由 1 000 次重復得到。

1.2.5 基因組織表達分析 分別取玉米的胚芽鞘、胚根、花藥、雄穗、穗軸、花絲、苞葉、穗位葉、莖、氣生根及根系，使用液氮速凍，并磨碎為粉末狀。后使用RNA提取試劑盒將這11個部位葉片提取RNA，并反轉錄為cDNA(參考1.2.1)，稀釋5倍至工作濃度備用。根據基因序列設計引物，在11份不同組織的cDNA中擴增待測基因和內參基因，本次組織定量試驗內參選擇為18S。PCR 程序為 95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，58 ℃ 5 s，40 個循環，每個樣本3個重復。實時熒光定量PCR體系參照表2。進行相對定量 qRT-PCR 分析，使用2-ΔΔ Ct法(Ct 表示循環數)對結果進行計算并使用 Excel 軟件對最終結果進行統計學分析并繪制最終的表達量圖表。

表2 實時熒光定量PCR體系Tab.2 PCR system of qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b基因克隆

使用引物TOC1a-F/R、TOC1b-F/R， 進行PCR擴增，得到ZmTOC1a的開放閱讀框的總長度為1 236 bp， 共編碼411個氨基酸；ZmTOC1b的開放閱讀框的全長為1 554 bp，共編碼 517 個氨基酸(圖1)。

2.2 玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b蛋白特性

使用ProtParam在線預測ZmTOC1a、ZmTOC1b表達蛋白的信息。結果表明，ZmTOC1a蛋白分子式為C1982H3103N585O647S17，分子質量為46.02 ku；ZmTOC1b蛋白分子式為C2468H3909N735O797S29，分子質量57.56 ku。理論上，ZmTOC1a蛋白親水性平均系數(GRAVY)為-0.818，脂肪系數(Aliphatic index)是56.47。ZmTOC1b蛋白親水性平均系數(GRAVY)為-0.600，脂肪系數(Aliphatic index)是 66.94。ZmTOC1a、ZmTOC1b均為不穩定蛋白(穩定系數大于40)，其中ZmTOC1a不穩定指數為58.88，ZmTOC1b不穩定指數為51.08 。另外，ZmTOC1a、ZmTOC1b在酵母(Yeast)內半衰期均大于20 h，在大腸桿菌(Escherichiacoli)內半衰期均大于10 h。對ZmTOC1a、ZmTOC1b編碼的氨基酸序列進行分析，結果表明，ZmTOC1a蛋白肽鏈帶負電荷的殘基總數(Asp+Glu)54，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)49，預測等電點(pI)為6.05(<7)，所以推測ZmTOC1a為酸性蛋白。ZmTOC1b蛋白肽鏈帶負電荷的殘基總數(Asp+Glu)65，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)60，預測等電點(pI)為6.30(<7)，所以推測ZmTOC1b為酸性蛋白。

A.ZmTOC1a;B.ZmTOC1b。

NetPhos 3.1 Server預測結果表明(圖2)，ZmTOC1a共存在46個磷酸化位點，其中絲氨酸36個，蘇氨酸8個，酪氨酸2個；ZmTOC1b共存在53個磷酸化位點， 38個絲氨酸位點，12個蘇氨酸位點，3個酪氨酸位點。據此推測ZmTOC1a、ZmTOC1b翻譯后的磷酸化修飾可能對蛋白功能產生重要的作用。

2.3 玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b系統進化樹分析

將玉米TOC1基因序列放在NCBI中Blast得到了小麥、大麥等幾種主要農業作物及其他植物中的TOC1基因。幾個主要物種中TOC1蛋白編號分別為XP_006647523.1(短穗野生稻，Oryzabrachyantha)、BAD38854.1(水稻，OryzasativaJaponica Group)、XP_002452462.1(高粱，Sorghumbicolor)、XP_004953120.1(谷子，Setariaitalica)、AMK48976.1(小麥，Triticumaestivum)、AEW48242.1(大麥，Hordeumvulgaresubsp.vulgare)。玉米中ZmTOC1a的編號為GRMZM2G020081,ZmTOC1b的編號為GRMZM2G148453。為了確認玉米ZmTOC1a及ZmTOC1b的系統進化位置，利用Mega 5.0軟件制作了TOC1同源基因的系統進化樹(圖3)，并進行了分析。結果發現，高粱中的TOC1基因與玉米TOC1基因親緣關系最近。

A.ZmTOC1a; B.ZmTOC1b。

圖3 玉米TOC1基因及同源基因系統發育樹Fig.3 Evolutionary tree of ZmTOC1 and other homologous gene

2.4 玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b亞細胞定位結果

將測序正確的載體pCAMBIA2300-35S:ZmTOC1a-eGFP，pCAMBIA2300-35S:ZmTOC1b-eGFP以及空載體pCAMBIA2300-35S:eGFP轉化農桿菌GV3101并進行菌液檢測，將檢測為陽性的農桿菌在含有抗性的YEB液體培養基中擴大培養，并注射煙草葉片。pCAMBIA2300-35S:eGFP作為陽性對照，48 h后進行觀察。亞細胞定位結果發現，試驗對照pCAMBIA2300-35S:eGFP空載體的綠色熒光分布在煙草葉片的細胞核、細胞質、質體以及細胞膜中;而在注射目的載體的煙草葉片的細胞核及細胞質內檢測到了綠色熒光蛋白，且細胞核內的綠色熒光信號與細胞核定位蛋白熒光信號相重合，因此，可以初步確定ZmTOC1a、ZmTOC1b主要定位在細胞核以及少量細胞質中(圖4)。

2.5 玉米ZmTOC1a、ZmTOC1b在不同組織中表達量分析

為了探究ZmTOC1a、ZmTOC1b的表達模式，使用qRT-PCR檢測基因在玉米11個不同組織中的表達量。結果顯示，ZmTOC1a及ZmTOC1b在多個組織中表達，但是在不同組織中表達量差異很大。其中2個基因分別在胚根以及胚芽鞘表達量最高。在穗位葉、胚芽鞘、胚根、莖、花絲中高表達，也在雄穗、氣生根、根中有表達，但是在花粉和苞葉中無表達(圖5)。

圖4 ZmTOC1a、ZmTOC1b在煙草葉片中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of ZmTOC1a，ZmTOC1b in tobacco

圖5 玉米B73 11個不同組織中ZmTOC1a及ZmTOC1b的表達量分析Fig.5 The expression of ZmTOC1a and ZmTOC1b in eleven different tissues of maize B73

3 結論與討論

生物鐘與開花調節的信號網絡緊密相連，這也就使得植物開花調節機制變得更為復雜。擬南芥中央振蕩器的主要組成部分AtTOC1會對LHY/CCA1的表達有促進作用，也與ZTL、FKF1、ABA等基因產生互作進而會對擬南芥的生物鐘產生影響。可是TOC1在玉米中的研究并不深入，并且筆者在MAIZE GDB中Blast得到了玉米中的2個同源基因ZmTOC1a、ZmTOC1b，因此研究TOC1在玉米中的作用也就更為必要。

使用PCR擴增得到了這2個基因的CDS序列，而后在線預測了ZmTOC1a、ZmTOC1b表達蛋白的信息。結果發現2個基因表達蛋白均為酸性。并且使用NetPhos 3.1 Server預測的結果表明，ZmTOC1a存在46個潛在磷酸化位點，ZmTOC1b存在53個潛在磷酸化位點。磷酸化是一種常見的可以調控蛋白功能和穩定性的修飾方式，據統計在人體中有500多個磷酸化激酶[34]。在目前已知的所有的翻譯后的修飾中磷酸化的種類和數目最多。推測ZmTOC1a、ZmTOC1b翻譯后的磷酸化修飾可能對蛋白功能產生重要的作用。而且信號蛋白的磷酸化會造成它所調控下游通路中的其他蛋白磷酸化，形成磷酸化級聯反應。另外，系統發育樹分析結果表明，ZmTOC1a、ZmTOC1b在同一個分支中，且與之親緣關系最近的是高粱中的TOC1基因。推測他們可能含有相類似的功能。有文獻表明AtTOC1為轉錄因子及轉錄抑制劑[35]，而大多數轉錄因子也是定位在細胞核中的。亞細胞定位結果顯示，ZmTOC1a及ZmTOC1b表達的蛋白主要定位在細胞核中，與預期結果一致。基因組織表達結果表明，ZmTOC1a及ZmTOC1b在胚芽鞘、穗位葉、花絲等組織中高表達。這與該基因感受、傳遞光信號，參與調控開花的功能相關，對ZmTOC1a及ZmTOC1b基因功能的進一步研究有重要的意義。

TOC1除了在光周期通路中發揮作用，也參與到了脫落酸反饋通路中[36]。脫落酸參與調控植物的發育和抗逆過程。Pokhilko等[37]對擬南芥野生型植株進行不同濃度ABA處理，發現高濃度ABA時，AtTOC1表達量上調，生物節律周期延長。Legnaioli等[38]將TOC1-ox、WT和TOC1的RNAi轉基因植株進行干旱處理，結果發現，TOC1過量表達的植株對干旱不耐受。TOC1基因在擬南芥中的其他功能有助于加強對ZmTOC1a及ZmTOC1b基因功能的理解，以及后續的功能探究。發掘與光周期敏感相關調控因子，揭示光周期調控途徑的分子機制，對于熱帶以及亞熱帶玉米優異種質資源的利用，植物花發育過程生物學機制的深入研究以及玉米分子育種均具有重要的理論和實踐意義。