板栗CmWRKY基因的克隆、序列分析與原核表達

劉裕峰，朱天輝，劉應高，譙天敏，李姝江，龍旭梅，韓 珊

(四川農業大學 林學院，四川 成都 611130)

植物已進化出各種防御機制以對抗病原微生物，在被病原體感染后，植物調節大量防御相關基因的轉錄表達[1]。其中，一些編碼具有抗微生物特性的病原體相關蛋白，例如葡聚糖酶和幾丁質酶，或參與抗微生物化合物(例如植物抗毒素)的生物合成的酶，從而有助于整體防御反應。其他基因編碼在引發植物防御反應的信號轉導途徑中起作用的蛋白質。

在植物中，對防御相關基因的及時轉錄調控對于擊敗病原體至關重要。WRKY家族蛋白是參與植物防御反應途徑調節的轉錄因子[2]。WRKY轉錄因子構成信號網絡的組成部分，調節許多植物過程，如葉子衰老[3]、種子發育[4]和植物對各種脅迫的反應，如生物脅迫和非生物脅迫[5-6]。WRKY轉錄因子含有1個或2個保守的DNA結合區域，稱為WRKY結構域[7]。WRKY結構域長約60個氨基酸殘基，其N-末端含有高度保守的氨基酸基序WRKYGQK，C-末端含有非典型的鋅指結構基序[8]。鋅指結構是C-X4-5C-X22-23-H-X-H或C-X7-C-X23-H-X-C[9]。重要的是這2個基序對于WRKY蛋白特異性結合稱為W-box的DNA序列基序(C/T)TGAC(C/T)至關重要[10]，其發生在WRKY蛋白質控制下的基因啟動子中。許多與防御有關的基因，包括PR基因，在其啟動子區域含有W-box[9]。病原體調節和/或水楊酸(SA)調節的擬南芥WRKY基因的啟動子基本上富含W-box[11]，表明WRKY基因的防御調節表達涉及轉錄激活和通過自我調節機制介導的抑制。

使用遺傳學和分子生物學方法逐漸闡明了各種WRKY轉錄因子的功能。越來越多的證據表明它們參與調節植物防御反應[12]。例如，病原體感染或用激素處理迅速誘導幾種植物物種中的WRKY基因表達。在黃瓜中，有4個WRKY基因的表達在植株遭受鐮刀菌酸(FA)處理后受到差異調節[13]。在馬鈴薯中，過表達StWRKY1的品系顯示出對致病疫霉的抗性增強[14]。過量表達西蘭花BoWRKY6的突變體表現出對霜霉病(Hyaloperonosporaparasitica)的高度抗性[15]。香蕉MaWRKY18基因可能在香蕉與病原菌(Fusariumoxysporum)互作過程中介導抗病性[16]。除了防御反應，WRKY轉錄因子也參與調節某些非生物應激反應。例如，在寒冷脅迫下水稻OsWRKY71過表達株系中2種冷應答基因OsTGFR和WSI76的表達升高，表明OsWRKY71是耐寒性的正調節因子[17]。WRKY基因的功能在各種植物中廣泛研究。

板栗(CastaneamollissimaBL)屬殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物，世界重要的干果之一，具有較高的營養價值。然而，栗疫病(Cryphonectricaparasitica)的出現，嚴重阻礙了其發展。通過基因工程的手段能夠提高板栗的抗病性，而WRKY轉錄因子在抗病過程中起著重要作用。目前為止，還未見到板栗WRKY基因的相關研究報道。本研究以板栗大紅袍為研究對象，從中分離了WRKY轉錄因子，并對其進行生物信息學和原核表達分析，旨在為該基因表達蛋白的純化、功能研究以及探討該基因在板栗抗病過程中的調控作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

板栗(大紅袍)幼苗來自四川農業大學林學院；pMD19-T載體、反轉錄試劑盒購于TaKaRa公司(大連)；DNA凝膠回收純化試劑盒購于索萊寶科技有限公司(北京)；質粒提取試劑盒購于天根生化科技有限公司(北京)；感受態細胞DH5α及BL21(DE3)購于全式金生物技術有限公司(北京)；BamH Ⅰ、XhoⅠ限制性內切酶、T4DNA連接酶購于NEB有限公司(北京)；pET-28a載體由四川農業大學林木病理實驗室提供。

1.2 板栗總RNA提取及cDNA合成

取100 mg健康板栗幼葉，經液氮充分研磨后，使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取的RNA通過紫外分光光度法測定其濃度和純度；板栗cDNA的合成參照TaKaRa公司反轉錄試劑盒說明書。

1.3 CmWRKY基因的克隆

參照板栗轉錄組數據庫(http://www.fagaceae.org/)和NCBI中其他樹種WRKY基因保守序列設計特異性引物CmWRKY-F1：5′-ATGGATACCAAA GAAGCAGAGAG-3′，CmWRKY-R1：5′-TCATCGTCGC TTGTCTTTACTT-3′。擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min， 40個循環。使用DNA膠回收試劑盒純化回收目的片段，回收片段與pMD19-T載體16 ℃過夜連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞，于Amp/X-gal/LB平板上進行藍白斑篩選，隨機挑取經PCR鑒定后的陽性克隆菌液，送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

1.4 CmWRKY基因的序列生物信息學分析

通過Blast進行基因序列同源性比對分析；分別運用ProtParam和ProtScale分析其編碼蛋白的理化性質和疏水性；利用ScanProsite分析編碼蛋白的功能位點及功能域；通過SPOMA和SWISS-MODEL對蛋白的二級結構和三級結構進行預測；分別使用TMHMM Server v. 2.0和SignalP 4.1 Server預測編碼蛋白的跨膜區和信號肽；利用MEGA 6.05繪制系統進化樹。

1.5 原核表達載體的構建及鑒定

根據板栗CmWRKY基因序列設計1對引物CmWRKY-F2：5′-CGGGATCCATGGCTTTCCGGCCTCT AT-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)，CmWRKY-R2：5′-CCGCTCGAGTCAAGGGCATTCTTTCTCA-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。以pMD19T-CmWRKY質粒為模板，進行PCR擴增，反應程序同1.3。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收目的片段。使用BamH Ⅰ和XhoⅠ內切酶分別酶切目的片段與pET-28a載體，酶切產物回收后16 ℃連接12 h。重組質粒pET28a-CmWRKY轉化BL21(DE3)感受態細胞，經卡那抗性篩選后，挑取單菌落于LB液體培養基擴增培養后進行PCR鑒定，提取陽性菌液質粒，經BamH Ⅰ 和XhoⅠ 雙酶切鑒定后，送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

1.6 CmWRKY蛋白的誘導表達

將pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)單菌落接種于LB液體培養基(含Kan，100 μg/mL)中，于37 ℃、180 r/min振蕩培養12 h。菌液擴增培養(V/V，1∶100)，當菌液OD600值約為0.6～0.8時，進行蛋白的誘導表達。以終濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG誘導6 h，收集1 mL菌液進行SDS-PAGE電泳檢測，篩選最優IPTG誘導濃度；以上述最優IPTG濃度分別進行2，4，6，8，10 h不同時間長度的誘導，篩選最優誘導時間長度；最后，分別以25，30，37 ℃進行誘導表達，篩選最優誘導溫度。以上述最優條件誘導表達CmWRKY蛋白，吸取1 mL菌液，12 000 r/min室溫離心10 min收集菌體，加入60 μL PBS Buffer(pH值7.4)重懸后，再次加入適量溶菌酶，利用液氮反復凍融6～8次，12 000 r/min 4 ℃離心20 min。分別收集上清和沉淀(用8 mol/L尿素4 ℃螯合30 min)。加入20 μL 4×Protein sds-page loading Buffer混勻，煮沸10 min，冷卻后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取10 μL上清進行蛋白電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 板栗CmWRKY基因克隆

以板栗幼苗葉片cDNA為模板進行PCR擴增，核酸電泳檢測顯示，在約1 500 bp位置處可見1條清晰的條帶(圖1)。該條帶純化回收后，與pMD19-T載體連接，轉化產物經過菌落PCR篩選陽性克隆，將鑒定的陽性克隆進行測序。測序結果通過生物信息學驗證，發現獲得1 437 bp的CmWRKY基因片段。

M. DL2000；1. 以cDNA為模板的PCR產物。M. DL2000; 1. PCR product of cDNA.

2.2 板栗CmWRKY基因的核苷酸序列分析

DNAMAN序列分析表明，該基因的開放閱讀框(ORF)為1 437 bp，編碼479個氨基酸(圖2)，將其核苷酸序列提交GenBank，基因登錄號：KY312850.1。BlastN比對結果顯示，該序列與巴旦木(Prunuspersica)等植物的WRKY基因一致性均在80%以上，其中與西班牙栓皮櫟(Quercussuber)WRKY基因一致性最高，達到97%，表明CmWRKY基因屬于板栗WRKY基因家族成員。

2.3 板栗CmWRKY蛋白的氨基酸序列分析

使用在線工具ExPASy ProtParam對CmWRKY蛋白質序列進行相關信息分析，結果表明：CmWRKY蛋白分子式為C2242H3589N675O734S12，分子質量為52.128 96 ku；理論等電點為9.15；在組成CmWRKY蛋白的所有氨基酸中，丙氨酸(Ala)比例最高，占總氨基酸量的7.1%，蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)比例最低，均為總氨基酸量的0.6%；其含有53個負電性氨基酸殘基(Asp+Glu)，66個正電性氨基酸殘基(Arg+Lys)；脂肪族氨基酸指數60.17，總平均疏水指數-0.872，屬于親水性蛋白。在線工具Motif發現，CmWRKY蛋白序列含有2個WRKY保守結構域，2個C2H2鋅指結構域(C-X4-C-X22-23-H-X-H)，屬于WRKY家族的第Ⅰ組(圖2)，BlastP分析進一步表明其屬于WRKY家族(圖3)。利用Clustal X1.81和ESPript 3.0軟件對CmWRKY及與其具有較高一致性的同源基因進行氨基酸序列上的比對分析，結果如圖4所示，CmWRKY與西班牙栓皮櫟(Quercussuber)、核桃(Juglansregia)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)及可可樹(Theobromacacao)WRKY功能區域的氨基酸序列高度保守，C2H2鋅指結構域也較為保守，推測CmWRKY與其高度同源的基因在調控特定的基因中發揮著相似的功能。

灰色區域.WRKY轉錄因子的特征序列WRKYGQK；下劃線.鋅指結構域C2H2，其中C和H殘基用方框標出；*.終止密碼子。The grey region. Characteristic sequence WRKYGQK of the WRKY transcription factor; The underlined portion zinc finger domain C2H2, wherein the C and H residues are indicated by boxes; *.The stop codon.

圖3 CmWRKY蛋白保守功能域Fig.3 The conserved domains of WRKY protein

圖4 CmWRKY與其他植物WRKY蛋白質序列多重對比Fig.4 Multiple alignment of the deduced protein of CmWRKY with other plant WRKY proteins

2.4 板栗CmWRKY蛋白的結構預測

在線軟件SignalP 4.1 Server對CmWRKY蛋白的氨基酸序列進行分析，發現CmWRKY蛋白不含信號肽，不屬于分泌型蛋白。通過TMHMM Server v.2.0預測CmWRKY蛋白跨膜區域，結果表明，該蛋白不含跨膜區域。利用SOPMA軟件分析，發現CmWRKY蛋白二級結構中，不規則卷曲結構(Random coil)所占比例最大，為73.01%；α-螺旋(Alpha helix)次之，為12.55%；延伸鏈結構(Extended strand)比例為11.09%；β-轉角(Beta turn)最少，僅為3.35%(圖5)。CmWRKY蛋白的三級結構分析表明，該轉錄因子的WRKY結夠域與AtWRKY1非常相似[18](圖6)，推測CmWRKY蛋白可能具有與AtWRKY1相類似的調控功能。同時，其結構域主要由4個β-折疊組成，依次為β-折疊1：WRKYGQK；β-折疊2：RSYYKC；β-折疊3：KKKVER；β-折疊4：AEIVYK。

最長豎線.α-螺旋；第2長豎線.延伸鏈；第3長豎線.β-轉角；最短豎線.無規則卷曲；橫向數值.氨基酸位置。The longest vertical bars.α-helix; The second longest vertical bars. Extended strand; The third longest vertical bars. Beta turn; The shortest vertical bars. Random coil; The horizontal numbers .The position of amino acid.

β-折疊1.WRKYGQK；β-折疊2.RSYYKC；β-折疊3.KKKVER；β-折疊4.AEIVYK。β-strand1. WRKYGQK; β-strand2.RSYYKC; β-strand3.KKKVER; β-strand4.AEIVYK.

2.5 板栗CmWRKY蛋白的同源進化分析

為了解CmWRKY蛋白和其他植物WRKY蛋白之間的進化關系，利用系統進化分析軟件Mega 6.05，通過鄰接法(Neighbor-Joining)方法構建CmWRKY與NCBI數據庫中29種植物WRKY的系統進化樹(圖7)。系統進化樹分析結果顯示，薔薇目(Rosales)、金虎尾目(Malpighiales)、錦葵目(Malvales)、無患子目(Sapindales)-(蕓香科，Rutaceae)、殼斗目(Fagales)-(殼斗科，Fagaceae)植物分別聚集在一起；其中，薔薇目下的榆科(Ulmaceae)、薔薇科(Rosaceae)及豆科(Fabaceae)植物又分別聚集在一起，相比豆科植物，榆科植物與薔薇科植物親緣關系更近；金虎尾目下的大戟科(Euphorbiaceae)植物聚集在一起。同時，葡萄(Vitisvinifera)和獼猴桃(Actinidiachinensis)由于均為藤本植物而聚集在一個分支。這些結果都符合植物的生物進化規律。

板栗與同為殼斗科的西班牙栓皮櫟親緣關系最近，其次為核桃，與蕓香科植物親緣關系也較近。這與CmWRKY和它們之間的氨基酸序列同源性較高相符合。

圖7 Neighbor-joining(NJ)方法構建CmWRKY蛋白與其他植物WRKY蛋白的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree between CmWRKY protein and other plant WRKY protein by Neighbor-Joining(NJ)method

2.6 原核表達載體的構建及鑒定

帶酶切位點的板栗CmWRKY基因片段和pET-28a載體經BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切后，回收酶切產物，產物通過T4DNA連接酶構建重組表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)。提取陽性菌液重組質粒，通過雙酶切鑒定可見預期大小的片段(圖8)。測序結果進一步表明，pET28a-CmWRKY原核表達載體構建成功。

M.DL5000；1.重組質粒pET28a-CmWRKY雙酶切產物；2.重組質粒pET28a-CmWRKY。M.DL5000; 1.Double enzyme product of pET28a-CmWRKY; 2.pET28a-CmWRKY plasmid.

2.7 pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)的誘導表達及條件優化

為進一步CmWRKY蛋白的功能研究提供試驗基礎，對該蛋白進行原核誘導表達。

IPTG濃度對CmWRKY蛋白表達的影響。選擇0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L 5個不同的IPTG濃度，在37 ℃下誘導6 h，經SDS-PAGE電泳分析顯示(圖9-A)，在各IPTG濃度下均能誘導表達出一條預期大小的融合蛋白，分子質量約為56 ku(CmWRKY蛋白52 ku+His-tag標簽蛋白4 ku)，且對照組均無目的蛋白表達，但不同IPTG濃度間表達量無明顯差異。以0.2 mmol/L IPTG作為最優誘導濃度。

誘導時間對CmWRKY蛋白表達的影響。pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)分別誘導2，4，6，8，10 h。結果顯示，不同誘導時間長度對該蛋白的表達量影響較為明顯，隨時間的增加，CmWRKY蛋白的表達量逐漸增加，在10 h蛋白的表達量達到最大(圖9-B)。因此，選擇誘導10 h作為最優誘導時間。

誘導溫度對CmWRKY蛋白表達的影響。pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)加入0.2 mmol/L IPTG分別在25，30，37 ℃下誘導10 h。結果顯示(圖9-C)，25 ℃誘導條件下幾乎無目的蛋白產生；30 ℃誘導條件下有目的蛋白產生且主要以可溶性蛋白的形式存在；37 ℃條件下誘導的目的蛋白可溶性量較少，主要以包涵體的形式存在。因此，選擇30 ℃作為pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)最優誘導溫度。

M. 蛋白質分子量標準；A. IPTG誘導濃度的優化：1. pET28a-BL21(DE3)未誘導；2. pET28a-BL21(DE3)誘導(0.6 mmol/L IPTG)6 h； 3-8. 終濃度為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG；B. 誘導時間的優化：1. pET28a-BL21(DE3)未誘導；2. pET28a-BL21(DE3)誘導(0.2 mmol/L IPTG)6 h；3-8. 誘導0，2，4，6，8，10 h；C. 誘導溫度的優化：1. pET28a-BL21(DE3)未誘導；2. pET28a-BL21(DE3)誘導(0.2 mmol/L IPTG)10 h；3. 未誘導；4. 25 ℃誘導上清；5. 25 ℃誘導沉淀；6. 30 ℃誘導上清；7. 30 ℃誘導沉淀；8. 37 ℃誘導上清；9. 37 ℃誘導沉淀。

M. Protein Marker; A. Optimization of IPTG induced concentration: 1. pET28a-BL21(DE3)without IPTG induction; 2. pET28a-BL21(DE3)was induced for 6 h(0.6 mmol/L IPTG); 3-8. pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced by 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L IPTG; B. Optimization of induction time: 1. pET28a-BL21(DE3)without IPTG induction; 2.pET28a-BL21(DE3)was induced for 6 h(0.2 mmol/L IPTG); 3-8. pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced for 0, 2, 4, 6, 8, 10 h; C. Optimization of induction temperature: 1. pET28a-BL21(DE3)without IPTG induction; 2. pET28a-BL21(DE3)was induced for 10 h(0.2 mmol/L IPTG); 3.pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)without IPTG induction; 4.Supernatant of pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced at 25 ℃; 5.Precipitate of pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced at 25 ℃; 6.Supernatant of pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced at 30 ℃; 7.Precipitate of pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced at 30 ℃; 8.Supernatant of pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced at 37 ℃; 9.Precipitate of pET28a-CmWRKY-BL21(DE3)was induced at 37 ℃.

圖9 重組表達質粒pET28a-CmWRKY誘導條件的優化
Fig.9 Optimization of induction condition of pET28a-CmWRKYplasmid

3 結論與討論

植物中WRKY蛋白基于存在的WRKY結構域的數量和鋅指的類型，WRKY蛋白質已被分類為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組，具有2個WRKY結構域的WRKY蛋白質屬于第Ⅰ組，具有一個WRKY結構域的蛋白質基于鋅指基序的特征屬于第Ⅱ組或第Ⅲ組[19]。通過氨基酸序列分析，本研究所克隆的CmWRKY蛋白具有2個WRKY結構域和2個鋅指結構，屬于第Ⅰ組。CmWRKY三級結構以AtWRKY1蛋白為模板同源建模獲得，Duan等[18]發現在AtWRKY1中，轉錄因子AtWRKY1與DNA的結合能力是由β2與β3之間的β折疊區域決定的，推測其與擬南芥AtWRKY1蛋白具有相似的功能。Agarwal等[20]研究發現，WRKY結構域由4條β-折疊組成，鋅配位Cys/His殘基形成鋅結合口袋，而本研究獲得的CmWRKY三級結構，也由4條β-折疊組成，與其研究結果一致。系統進化分析表明，CmWRKY蛋白與其他物種間的WRKY蛋白同源性較高，與同為殼斗科的西班牙栓皮櫟親緣關系最近，其次為核桃，聚集為一個分支。西班牙栓皮櫟QcWRKY蛋白功能未見相關報道，核桃JrWRKY4參與低溫脅迫反應[21]，推測CmWRKY可能也參與低溫脅迫的生理過程。

為進一步研究板栗CmWRKY蛋白的生物學功能，利用基因工程技術構建了pET28a-CmWRKY原核表達載體，轉入BL21(DE3)后進行原核表達，獲得了分子質量約為56 ku的目的蛋白，比預測分子質量略大，主要是由于His-tag標簽序列造成的[22]。大腸桿菌作為常用的原核表達系統，除了選擇合適的載體和表達菌株之外，IPTG濃度、誘導時間及誘導溫度等培養條件對其蛋白表達也具有較大的影響[10]。本研究也從這3個方面對CmWRKY蛋白的誘導表達進行優化，以期獲得最大量的目的蛋白。SDS-PAGE分析顯示，不同IPTG濃度下均能誘導表達出預期大小的融合蛋白，且不同誘導濃度間表達量并無差異，而低濃度IPTG誘導有助于可獲得較多的可溶性蛋白[10]，因此，選擇低濃度IPTG(0.2 mmol/L)誘導。隨著誘導時間的增加，CmWRKY蛋白表達量 逐漸增加，在10 h時表達量達到最大。本研究發現，CmWRKY蛋白在較高溫度(37 ℃)誘導下，主要以包涵體的形式存在。研究表明，高溫條件下，蛋白表達過快，不能正常折疊，容易形成包涵體[23]。但在較低溫度(25 ℃)誘導下，幾乎無目的蛋白產生，可能是溫度過低的原因。而在30 ℃誘導溫度下，CmWRKY蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在。因此，利用大腸桿菌表達系統，在30 ℃，0.2 mmol/L IPTG誘導表達菌株10 h能獲得最大量的可溶性CmWRKY蛋白。

本研究成功從板栗中克隆了一個CmWRKY基因，其氨基酸序列中含有2個WRKY保守結構域和2個C2H2鋅指結構域，屬于WRKY家族的第Ⅰ組。利用多種生物信息學軟件分析了CmWRKY基因的同源性、蛋白質結構、系統進化等相關信息。初步探索了CmWRKY基因的原核表達情況，為其蛋白功能研究奠定了基礎，也為揭示該基因在板栗抗病過程的分子調控打下基礎。