擬南芥VHA-c1基因對非生物脅迫的響應

韓曉東，郭榮起，高 陽，于秀敏，蘇 杰，張子義，李國婧，王瑞剛

(1. 內蒙古農業大學 內蒙古自治區植物逆境生理與分子生物學重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018； 2. 呼倫貝爾市農業科學研究所，內蒙古 扎蘭屯 162650 ；3. 中國農業科學院 草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010018；4. 內蒙古農業大學 職業技術學院，內蒙古 包頭 014109)

質子泵是氧化磷酸化過程中合成ATP的能量系統，存在于幾乎所有的真核細胞內。植物液泡質子泵(V-ATPase)最早發現于液泡中，是一種由13個亞基組成的多亞基復合體酶，由V1和V02個結構域構成類似“球莖”的結構[1]。其中，V1域突出膜外，由A～H共8個亞基構成。V0域鑲嵌于膜內，由a、c、c′、e和d共5個亞基組成[2]。

在對V-ATPase各亞基的研究中，c亞基備受關注，它與酵母Vma3p的c亞基同源。分子質量約為16 ku，是形成V0膜域的主要組件。同時，也是質子轉運的通道，與H+轉運有關[3]。此外，c亞基對V1與V0結構域的裝配也是必不可少的。有報道稱c亞基是細胞通訊中間隙聯結的部分，是神經遞質釋放介導體的組分，也是某種罕見的病毒癌基因產物的靶蛋白[4]。c亞基在細胞信號轉導過程中起重要作用。

研究發現，當植物處于逆境環境中，V-ATPase 能夠通過結構、狀態及植物體內數量的改變來適應環境的改變，從而降低逆境對其造成的傷害[5-7]。在高鹽、寒冷、干旱等環境下，山墻蘚(Tortularuralis)、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、二色補血草(Limoniumbicolor)中的V-ATPase轉錄水平和活性都明顯提高[8-9]。Xu等[10]將二色補血草的VHA-c1基因在煙草(NicotianatabacumL.)中過表達后，可以顯著增強轉基因煙草對鹽脅迫的耐受能力，研究認為這是由于轉基因株系中超氧化物歧化酶與過氧化物酶被顯著激活，能夠有效地清除細胞內的氧化物質，使細胞膜不被氧化達到保護細胞完整性的作用、進而提高細胞耐受高鹽環境的能力。

為了更深入地了解擬南芥VHA-c1基因的功能，本研究利用RNA干擾技術構建了VHA-c1基因沉默的轉基因純合株系，并對其純合體進行了鹽脅迫、外源ABA和糖處理，旨在為進一步探明VHA-c1基因在植物非生物脅迫方面的抗性機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

根癌農桿菌GV3101、大腸桿菌DH5α、pHANNIBAL載體、pART27載體和擬南芥(Columbia，Col-0)由內蒙古自治區植物逆境生理與分子生物學重點實驗室保存。擬南芥培養條件：22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對濕度60%。

1.2 試驗方法

1.2.1VHA-c1基因沉默載體的構建與農桿菌轉化 采用CTAB法[11]提取擬南芥基因組DNA，以其為模板PCR擴增VHA-c1目的片段。正義鏈(Sense)特異引物為c1-s-5和c1-s-3，反義鏈(Anti-sense)特異引物為c1-as-5和c1-as-3，具體的引物序列與引入的酶切位點見表1。凝膠純化回收PCR產物，利用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切的方法將正義鏈和pHANNIBAL載體連接，測序鑒定正確命名為pHAN-c1-s。同理，利用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切方法將反義鏈與pHAN-c1-s載體相連接，測序鑒定正確命名為pHAN-c1-s-as。最后，用NotⅠ單酶切pHAN-c1-s-as質粒，回收包含35S啟動子、ocs終止子、c1-s和c1-as片段，并與經NotⅠ酶切pART27載體的回收片段相連接，測序正確的重組表達載體命名為pART-c1。

將pART-c1載體用電擊法[12]轉化到農桿菌GV3101細胞中，在含25 μg/mL慶大霉素和100 μg/mL放線菌素的固體培養基平板上篩選陽性克隆。用c1-s-5或c1-as-3為引物，進行菌落鑒定，鑒定為陽性的保種，用于下一步轉化植物。

1.2.2VHA-c1基因沉默植株的篩選及純系的獲得 擬南芥的轉化采用浸花法[13]，轉化后將擬南芥在正常條件下繼續培養21～28 d，收取成熟種子。將種子播種于含30 μg/mL卡那霉素的1/2 MS選擇培養基中，22 ℃培養10～12 d后挑選陽性植株，待其成熟后分單株收取種子(T1)；T1種子按單株種于含30 μg/mL卡那霉素的選擇培養基上，選擇有1/3性狀分離的株系，將綠苗移至蛭石上培養，單株收取種子(T2)；T2種子按單株在含30 μg/mL卡那霉素的培養基上繼續篩選，不再分離的即為純合體株系，用于各項指標的分析。

1.2.3 RT-PCR半定量VHA-c1基因沉默效果 提取擬南芥野生型(CK)和VHA-c1基因沉默株系總RNA[14]，反轉錄cDNA。以cDNA為模板，分別以c1-RT-F和c1-RT-F為引物PCR擴增VHA-c1，以actin-RT-F和actin-RT-R為引物擴增內參基因actin(At3g12110)。將PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析結果。

1.2.4 基因沉默株系c1-1的脅迫處理與表型分析 擬南芥野生型和VHA-c1基因沉默株系種子同時種在1/2 MS 培養基中，4 ℃春化 3 d，22 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養 5 d后，同時分別轉移到含有0，25，50，100 mmol/L NaCl和含有0，4，8，12 μmol/L ABA的 1/8 MS 的平板上，光下豎直放置4 d，記錄主根相對伸長量。

野生型和VHA-c1基因沉默株系種子同時種在含有50 mmol/L NaCl及6%葡萄糖的 1/2 MS 培養平板上，4 ℃春化3 d。然后，在22 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養 ，此刻計時為0 h，并再后續的24，48，72，96 h時間點統計種子萌發率。

表1 特異性引物與酶切位點Tab.1 The specific primers sequences and restriction sites

2 結果與分析

2.1 VHA-c1基因沉默株系的篩選與鑒定

基因沉默質粒pART-c1經農桿菌介導轉化野生型擬南芥。經過抗生素篩選，最終獲得了5株T2轉基因純合株系，分別命名為c1-1、c1-2、c1-3、c1-4、c1-5。分別提取其RNA，反轉錄得到cDNA。利用半定量RT-PCR技術，分別擴增actin基因和VHA-c1基因。微調凝膠電泳上樣量，在actin基因轉錄量相同的情況下，比較5株基因沉默株系與野生型的VHA-c1表達量。結果顯示：c1-1和c1-2株系的VHA-c1基因幾乎95%被沉默，而其他3株系都有不同程度的表達(圖1-A)。因此，選擇c1-1株系用于后續的功能試驗。

由于VHA-c1～c5基因具有很高的序列同源性，對設計的siRNA-c1沉默片段特異性進行測定。結果表明：設計的基因沉默片段特異性非常好，它只對VHA-c1基因沉默，并不影響其他4個VHA-c2～c5基因的表達(圖1-B)。

2.2 NaCl處理VHA-c1基因沉默株系主根伸長與種子萌發的變化

在前期的研究中發現VHA-c1過表達的轉基因植株表現出很強的NaCl耐受性[15]。因此，為了進一步明確VHA-c1基因與NaCl耐受性之間的關系，對基因沉默株c1-1在不同濃度NaCl下培養，測量其根相對伸長量。結果表明：25，50，100 mmol/L的NaCl濃度下，VHA-c1基因沉默的株系的根相對伸長量都小于野生型，特別是在NaCl濃度為50 mmol/L時，VHA-c1基因沉默株系根伸長量比對照減少12%(圖2-A)。

A.VHA-c1基因沉默株系中VHA-c1基因的表達水平檢測;B. RNAi 突變純合體 c1-1 中VHA-c1基因沉默特異性檢測; Control.野生型; c1-1～c1-5.轉基因植株。圖2-4同。

A.Detection ofVHA-c1mRNA expression in silenced homozygous plants by RT-PCR； B. Specificity detection ofVHA-c1silencing construct in homozygous line c1-1；Control. Wild type；c1-1-c1-5. Transgenic plants. The same as Fig.2-4.

圖1c1基因沉默株系中VHA-c1基因的表達水平與半定量RT-PCR檢測
Fig.1 Detection ofc1gene mRNA expression and specificityin silenced homozygous plants by semi-quantitative RT-PCR

A. 在含 NaCl 的培養基上 VHA-c1 基因沉默突變純合體根的相對伸長量；B. VHA-c1 基因沉默突變純合體在 50 mmol/L NaCl 處理下的萌發率。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。A. Relative root growth of VHA-c1 silenced homozygous seedlings on MS containing different concentrations of NaCl； B.Germination rate of VHA-c1 silenced homozygous lines on MS containing 50 mmol/L NaCl.Different lowercase letter indicate significant differences (P<0.05).The same as Fig.3.

50 mmol/L NaCl對基因沉默株c1-1的種子萌發率結果表明：隨著NaCl處理時間的增加，VHA-c1基因沉默株系種子的萌發被嚴重的抑制(圖2-B)。綜上，VHA-c1基因與植物應對NaCl脅迫具有直接的關系。

2.3 ABA處理VHA-c1基因沉默株系主根伸長的變化

不同濃度ABA處理基因沉默株c1-1與野生型擬南芥，隨著ABA濃度的增加，c1-1和野生株的主根生長被抑制的程度均增加。但是，相對于野生型擬南芥，基因沉默株的主根被ABA抑制的程度較小。特別是在4，8 μmol/L ABA濃度下，c1-1株系的主根相對伸長量平均比野生株系分別長32%，48%(圖3)。

圖3 ABA處理VHA-c1基因沉默株系根相對伸長量的變化Fig.3 The relative root growth assay of VHA-c1 gene silenced homozygous plants under ABA stress

2.4 葡萄糖處理VHA-c1基因沉默株系種子萌發率的變化

通常在研究植物響應ABA脅迫處理的過程中，也要研究植物響應糖處理的試驗，這是由于糖脅迫信號通路與ABA信號通路的相關性所致。本試驗選擇了6%的葡萄糖作為糖脅迫材料，分別對擬南芥進行24，48 ，72 ，96 h的脅迫處理。結果表明：從24 h后開始，基因沉默株系c1-1種子的萌發率與野生型株系種子的萌發率在這4個時間節點上幾乎沒有明顯區別(圖4)。

圖4 葡萄糖處理VHA-c1基因沉默株系種子的萌發率Fig.4 The germination rates assay of VHA-c1 gene silenced homozygous plants under glucose stress

3 結論與討論

已有報道，V-ATPase通過c亞基表達量的變化，影響細胞擴展[16]。其機制是V-ATPase利用液泡中ATP所釋放的能量將H+泵到液泡腔中，產生H+電化學梯度，使液泡酸化，為物質運輸提供能量，從而影響膨壓和細胞擴增[17-18]。本研究利用高度特異性的RNA干擾技術，沉默VHA-c1基因，獲得了穩定的擬南芥株系c1-1。

V-ATPase的一個重要功能就是將H+泵入膜內的同時，伴隨著將Na+泵出膜外。多數植物種，隨著環境中NaCl濃度的提高，V-ATPase的轉錄水平與生物活性都有所增加。在筆者前期的研究中，過表達VHA-c1基因后，顯著提升過表達株系的NaCl耐受能力[19-20]。本研究將VHA-c1基因沉默后，在系列NaCl濃度梯度脅迫下沉默株系的根相對伸長量與種子的萌發率都有明顯的降低，在濃度為50 mmol/L和100 mmol/L NaCl脅迫處理下，VHA-c1基因沉默株系的主根相對伸長量被顯著抑制。這意味著VHA-c1亞基表達與其對NaCl脅迫的耐受性有著直接的關系。

脫落酸(ABA)作為一種重要的植物激素，參與植物胚胎發育、種子休眠、果實成熟等生理活動；同時，它在植物抵抗非生物脅迫過程中起著非常關鍵的作用[21-22]。用不同濃度的ABA處理VHA-c1基因沉默株系探究ABA 與VHA-c1的關系。結果表明，基因沉默和對照株系的幼苗都隨著ABA濃度的增加，它們的根相對伸長量都在減小。VHA-c1基因沉默株系的根伸長量均長于對照株系。特別是在濃度為4，8 μmol/L ABA脅迫處理后，c1-1株系的主根相對伸長量顯著(P<0.05)長于野生株系的主根伸長量。另外，VHA-c1基因沉默株系在含有6%的葡萄糖MS平板生長時，其種子的萌發率和野生型株系的種子萌發率是相同的。這進一步說明VHA-c1基因對ABA的脅迫不敏感，這可能是因為H+-ATPase在鹽脅迫信號通路和ABA信號通路中起著不同的調控功能。

綜上所述，本研究獲得了擬南芥VHA-c1基因特異性沉默株系，對其進行NaCl、ABA處理后發現其表型與野生型不同，為進一步研究VHA-c1基因在植物生長發育、激素響應和抗逆境過程中的功能奠定了基礎。