熒光原位雜交技術在產前染色體病診斷中的應用價值

馮莉 王曉華 白瑞芳 周燕 董弘 冀小平

熒光原位雜交技術(flourescence in situ hybridization，FISH)是將分子生物探針與染色體特定位點結合來檢測染色體異常的一類技術。在上世紀80年代中期，D’Alton等[1]應用FISH技術檢測到間期細胞核中數目異常的染色體。理論上FISH技術可以檢測所有染色體數目異常，由于13、18、21號以及X、Y染色體發生非整倍體畸變的頻率較高，占所有染色體病的65%～80%，因此設計這五條染色體的探針將其應用到產前診斷中可以快速檢測常見染色體非整倍體畸變，易于普及，并具有一定臨床應用價值。

對象與方法

1. 研究對象：本研究對象來源于2015年1月—2017年6月期間在內蒙古自治區婦幼保健院進行產前診斷的孕婦。孕婦年齡分布為18～46歲，平均年齡(33.0±5.8)歲；孕周大多集中在22周左右，其中最小孕周為17周+1天，最大33周。

2 .實驗方法：采集篩查高風險、超聲提示胎兒異常以及高齡孕婦的羊水199例，進行核型分析及FISH檢測。

(1)染色體核型分析實驗方法：離心收獲羊水細胞，加入5 ml培養液，分裝入兩個培養瓶中，在37℃溫箱中培養，培養7～8天后換液。在第10～12天，鏡檢細胞群落長勢良好，則加入秋水仙素，繼續培養2～4 h；處理后取出培養瓶，加入EDTA胰酶消化。收集培養后羊水細胞進行低滲、固定再處理、滴片、烤片后進行染色體鏡檢。

(2)FISH檢測實驗方法：玻片樣本處理，探針雜交，洗片，DAPI染色。閱片：熒光顯微鏡下隨機計數50個強信號且無重疊的雜交細胞。結果判讀：鏡下閱片若大于90%的核型顯示非整倍體信號則判斷為異常。若10%～60%的核型顯示非整倍體信號則判斷為嵌合體。如果無法判斷則擴大計數100個細胞。

3.實驗主要儀器及試劑：實驗主要儀器有熒光原位雜交系統，染色體分析系統，培養箱。實驗主要試劑為DNA FISH探針(北京金菩嘉公司18、X、Y、21、13五色探針)。

4.數據統計和分析：使用SSPS 19.0軟件對實驗數據進行統計學分析，計數資料用百分數或者率(%)表示。

結果

1. 染色體核型分析結果：進行產前診斷的主要為血清學篩查高風險、無創篩查高風險、高齡以及超聲異常等病例，本研究中共檢測出染色體非整倍體63例，占總檢測數的31.7%。具體各組染色體異常情況見表1。

2. 染色體異常分類情況對比分析：對所有研究對象進行染色體核型分析和FISH檢測發現，有2例染色體核型分析未檢測到異常，而FISH檢測結果為21-三體。13-三體和18-三體檢測結果FISH與核型分析完全一致。性染色體異常組FISH漏診1例核型為47，XXY，FISH檢測為兩個X信號，未發現Y信號，標本狀態顯示血性羊水，考慮為母血污染。在結構異常組，核型分析為羅氏易位型13-三體及21-三體的樣本均成功檢測。FISH探針采用的是特異位點探針和著絲粒探針，1例18號染色體短臂的部分缺失由于不是本研究檢測的目標區域，未成功檢測。1例9號多態、1例嵌合體漏診。核型分析正確率為96.9%(63/65)，FISH檢測正確率為93.8%(61/65)，結果見表2。

表1 染色體核型結果分析

表2 五色探針檢測情況分析

3. 核型分析染色體結構異常6例情況及兩種檢測方式漏檢、培養失敗情況分析：兩種檢測方式不一致的病例詳情見表3。核型分析結果為結構異常的6例病例，均不在FISH檢測探針設計范圍之內。但是其中核型分析為羅氏易位的FISH結果與核型結果一致。同時由于FISH技術不能準確檢測嵌合體，故漏檢1例。染色體核型分析培養失敗的3例均經FISH檢測成功。

表3 核型分析結構異常、核型培養失敗及FISH漏檢情況

討論

1. FISH檢測技術在臨床應用方面的優勢：目前，依賴于G顯帶的染色體核型分析技術仍是染色體疾病診斷的“金標準”，可以準確地檢出染色體非整倍體，也可以檢測一定范圍的結構異常。但受到自身技術的局限仍有一些不足之處，診斷周期長，對孕周要求嚴，實驗失敗率高等[3]。

本研究中的199例羊水標本培養時間范圍在14～28 d不等，平均檢測時間在21 d左右，最長1例培養時間為31 d。核型培養失敗3例，培養成功率為98.5%。發放報告時間在24～48 h內。研究中，培養失敗的3例孕婦均拒絕進行二次羊水穿刺，經FISH檢測，2例胎兒診斷為21-三體，1例胎兒正常。由于FISH技術是用已知核酸序列作為探針與靶DNA進行原位雜交，觀察熒光信號進行診斷，降低了實驗操作與結果分析的難度[4]。Choolani M等[5]認為當羊水細胞難以培養時，在檢測量大的實驗室可以應用FISH代替核型分析來檢測染色體異常。

2. FISH可以準確檢測染色體非整倍體：FISH檢測技術具有良好的實用性，靈敏度和特異性分別可達99.9%和100%[6]。由于在目前所有的染色體非整倍體畸變中，21、18、13號及性染色體非整倍體發病率約占65%～80%[7]，檢測這幾類常見染色體數目，可滿足部分產前診斷的需要。本研究檢出65例異常結果，1例9號多態、1例18號短臂缺失和1例嵌合體外，余下62例(95.4%)均為常見染色體非整倍體。

3. FISH技術目前存在的一些局限性：一般認為，FISH技術難以檢出嵌合體。嵌合體患兒體內嵌合細胞比例，將決定雜交信號的檢出率。對于較小的嵌合體，FISH難以做出精確判斷，必須結合核型分析結果來全面判斷。FISH也不能進行探針設計目標結構區外異常的檢測。因此在產前診斷過程中要把握好應用指征，準確定位，與核型分析的結果相互補充。

綜上所述，FISH技術在產前遺傳性疾病檢測中，可以對常見染色體非整倍體進行準確的檢測。可以與核型分析互為補充，為臨床提供更全面的服務。