自噬相關(guān)蛋白LC3和E-鈣黏蛋白、波形蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)

代小燕，邸石，靖芳

作者單位：武漢市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430061

子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥）是不孕癥和慢性盆腔疼痛的常見原因，其特征是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)的子宮腔外生長，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢。內(nèi)異癥雖是良性疾病，但具有類似惡性腫瘤廣泛種植及侵襲生長能力的生物學(xué)行為。黏附-侵襲-血管生成是子宮內(nèi)膜異位癥異位種植發(fā)生病變的基本病理生理過程［1］。已有研究表明，自噬廣泛參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，并對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生進(jìn)行調(diào)控［2］。本研究旨在探討自噬相關(guān)蛋白LC3以及和EMT相關(guān)的E-鈣黏附蛋白（E-cadherin），波形蛋白（Vimentin）在子宮內(nèi)膜異位癥病人異位及在位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，探討其與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2018年1—11月在武漢市第三醫(yī)院婦科行腹腔鏡或開腹手術(shù)治療的41例卵巢子宮內(nèi)膜異位癥合并有子宮腺肌病，因病變廣泛、痛經(jīng)癥狀進(jìn)行性重，保守治療無效且無生育要求而行全子宮切除術(shù)病人，術(shù)中留取在位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜，分為在位內(nèi)膜組和異位內(nèi)膜組，平均年齡（39±3.5）歲；選取同期38例因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)病人為對照組，術(shù)中留取正常子宮內(nèi)膜，為正常內(nèi)膜組，平均年齡（41±2.3）歲。各組病人在年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。選取病人均有規(guī)律的月經(jīng)周期，術(shù)前至少6個月未服用任何激素類藥物，無其他內(nèi)分泌及內(nèi)外科合并癥。在增殖期收集子宮內(nèi)膜標(biāo)本，臨床診斷均以術(shù)后病理結(jié)果為準(zhǔn)。該實(shí)驗(yàn)在標(biāo)本采集前均告知并簽署知情同意書，本研究的倫理批準(zhǔn)來自湖北省武漢市第三醫(yī)院倫理委員會（武三醫(yī)倫KY2018-013）。

1.2子宮內(nèi)膜組織中LC3B、E-cadherin和Vimentin表達(dá)檢測將新鮮手術(shù)標(biāo)本在10%甲醛中固定24 h，然后包埋在石蠟塊中。將甲醛固定和石蠟包埋的子宮內(nèi)膜組織切成5 μm，并安裝在經(jīng)乙醇清潔的載玻片上。經(jīng)過脫蠟、脫苯、水化后采用SP法檢測LC3、E-cadherin和Vimentin表達(dá)，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司，步驟參照試劑盒說明書。每張切片隨機(jī)取20個高倍鏡（×200）視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，無細(xì)胞著色為（-），陽性細(xì)胞數(shù)百分比＜25%（+）、26%～50%（++）、51%～75%（+++）、＞76%（++++），+～++++均記為陽性表達(dá)，計(jì)算陽性表達(dá)率。分析子宮內(nèi)膜組織中LC3、E-cadherin和Vimentin表達(dá)的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 子宮內(nèi)膜異位癥41例和子宮肌瘤38例代表性的染色實(shí)例（免疫組織化學(xué)染色）

2 結(jié)果

運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色檢測LC3、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)，代表性的染色實(shí)例見圖1。LC3定位在腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；E-cadherin定位于兩種細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；Vimentin定位于基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。異位子宮內(nèi)膜組中LC3的陽性表達(dá)率顯著高于正常子宮內(nèi)膜組和在位子宮內(nèi)膜組（P＜0.05），LC3的陽性表達(dá)率在正常子宮內(nèi)膜組和在位子宮內(nèi)膜組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；異位子宮內(nèi)膜組和在位子宮內(nèi)膜組中E-cadherin陽性表達(dá)率均低于正常內(nèi)膜組（P＜0.05）；異位子宮內(nèi)膜組和在位子宮內(nèi)膜組中Vimentin陽性表達(dá)率均高于正常內(nèi)膜組（P＜0.05）。異位內(nèi)膜組中自噬相關(guān)蛋白LC3與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.627，P＜0.05），LC3 和 Vimentin（r＝0.537，P＜0.05）表達(dá)呈正相關(guān)，E-cadherin與 Vimentin（r＝-0.615，P＜0.05）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。各組LC3、E-cadherin和Vimentin陽性表達(dá)率比較見表1。

表1 子宮內(nèi)膜異位癥41例和子宮肌瘤38例各組LC3B、E-cadherin和Vimentin表達(dá)比較/例（%）

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡女性的常見病及難治病，嚴(yán)重影響女性健康和生活質(zhì)量。Sampson的經(jīng)血逆流學(xué)說是內(nèi)異癥經(jīng)典理論，但不能解釋90%的經(jīng)血逆流發(fā)生率，而只有10%～15%女性發(fā)生內(nèi)異癥的現(xiàn)象。子宮腔外子宮內(nèi)膜組織的遷移，侵襲和血管生成是子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)展的關(guān)鍵步驟［3］。子宮內(nèi)膜異位癥是一種多因素疾病，其發(fā)病機(jī)制一直是婦科基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)，迄今為止，內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制仍不明確。

自噬是一種高度保守的細(xì)胞行為，是細(xì)胞應(yīng)對營養(yǎng)缺乏、缺氧、感染等惡劣環(huán)境因素的生存機(jī)制之一，其可通過降解胞質(zhì)內(nèi)受損細(xì)胞器，產(chǎn)生氨基酸與游離脂肪酸以供蛋白質(zhì)和能量的合成，其通過維持腫瘤細(xì)胞在代謝應(yīng)激環(huán)境下存活來促進(jìn)轉(zhuǎn)移進(jìn)程［4］。已有有研究表明，自噬廣泛參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，并對EMT的發(fā)生進(jìn)行調(diào)控［5］。自噬能夠激活EMT促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲：TGF-β1作為EMT發(fā)生最重要的誘導(dǎo)因子，能夠激活自噬；而自噬激活可使肝癌細(xì)胞的TGF-β1表達(dá)水平顯著上升，進(jìn)一步使肝癌發(fā)生EMT與獲得侵襲轉(zhuǎn)移表型，從而形成正反饋的循環(huán)效應(yīng)［6］。已知LC3（酵母Atg8的哺乳動物同源物）存在于自噬體上，并且LC3 I-II的轉(zhuǎn)化是監(jiān)測該過程的廣泛使用的標(biāo)志物［7］，因此LC3的表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)。近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)自噬與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系，有研究表明，自噬在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中被上調(diào)，并且可能有助于子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的存活和異位部位的病變維持［8］。然而，關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥中自噬的表達(dá)水平存在爭議性結(jié)果，Choi及其同事報道，異位內(nèi)膜中的自噬水平降低，同時p70S6K磷酸化的激活（mTOR激活的特征）［9］。

EMT是指在某些特殊的生理或病理?xiàng)l件下，上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力的過程［10］。上皮細(xì)胞標(biāo)志物如ECadherin表達(dá)下調(diào)或缺失是EMT的最重要的標(biāo)志性變化，也是上皮腫瘤細(xì)胞侵襲的前提條件［11］。間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞中最主要的中間纖維，其表達(dá)升高是導(dǎo)致E-Cadherin表達(dá)缺失的原因之一，同時會干擾E-Cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞黏附作用。基于EMT的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)異癥異位種植和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征相契合，近年來EMT與內(nèi)異癥發(fā)病的關(guān)系引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注［12］。EMT失衡可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位性疾病發(fā)生的機(jī)制之一，有研究證實(shí)在異位內(nèi)膜中EMT的發(fā)生在促進(jìn)內(nèi)異癥異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色［13］。

本研究通過免疫組化SP法檢測LC3和EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin在正常子宮內(nèi)膜、在位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況，并做相關(guān)性分析。本研究結(jié)果顯示，以正常子宮內(nèi)膜作為對照，子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜組中LC3的陽性表達(dá)率顯著高于正常子宮內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜異位癥病人在位子宮內(nèi)膜組（P＜0.05），且異位內(nèi)膜組中E-cadherin表達(dá)陽性率明顯低于正常子宮內(nèi)膜中E-cadherin表達(dá)陽性率（P＜0.05），異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)陽性率明顯高于正常內(nèi)膜上皮細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)陽性率（P＜0.05），在異位內(nèi)膜組中，三者表達(dá)具有相關(guān)性?？傊?，在異位子宮內(nèi)膜組織中，自噬表達(dá)水平上調(diào)伴有EMT現(xiàn)象的發(fā)生。我們推測，自噬表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜組織上皮細(xì)胞EMT的形成，從而促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致異位病灶的發(fā)生、發(fā)展，抑制自噬可能作為預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥的新靶點(diǎn)，但其確切的機(jī)制有待深入探討。