發酵前后不同分子量段全蝎白術混合品體外抗腫瘤研究

毛會秀 陳美琦 劉金虎 呂迎蘭 方園 張瑞 王集會

摘要：目的? 研究全蝎白術混合發酵品的抗腫瘤活性，確定藥物抗腫瘤的活性部位。方法? 依據雙指標優化提取工藝的最優條件對全蝎白術混合發酵品進行超聲提取。采用超濾手段，分別用截留量為5 kD和10 kD的超濾膜對水提液進行超濾分段，測定各分子量段中蛋白質和多糖的含量，采用MTT法檢測體外抗腫瘤活性，并以未發酵品做對照。結果? 各分子量段對2種腫瘤細胞抑制效果具有差異性，醇沉上清液對腫瘤細胞的抑制效果最好，其次為分子量段>10 kD全蝎白術混合發酵品，且全蝎白術混合發酵品對腫瘤細胞抑制作用顯著優于未發酵品。結論? 全蝎白術混合發酵品對乳腺癌細胞、喉癌細胞均有較高的抑制作用，其活性部位主要為醇沉上清液和分子量段>10 kD全蝎白術混合發酵品。

關鍵詞：全蝎白術混合發酵品;超濾分段;抗腫瘤

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0040-04

Abstract： Objective To study the antitumor activity of Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product; To determine the antitumor active sites of Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product. Methods Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product was extracted by ultrasonic assay on the basis of the optimal conditions of the double index optimization extraction process. The water extract was segmented by ultrafiltration membrane with a retention of 5 kD and 10 kD respectively. The contents of protein and polysaccharide in each molecular weight segment were determined. MTT assay was used to study the antitumor activity in vitro. The unfermented product was used as the control group. Results The inhibitory effects of different molecular weight segment on the two tumor cells were different， and the inhibitory effects of alcohol supernatant on the tumor cells were the best， followed by the SAHFP of molecular weight >10 kD segment. Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product was significantly better than that of unfermented products. Conclusion Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product has a high inhibitory effect on breast cancer cells and laryngeal cancer cells. The active sites of antitumor drugs are mainly the alcohol supernatant and the Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation product of molecular weight >10 kD segment.

Keywords： Scorpio and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma mixed fermentation; ultrafiltration segment; antitumor

全蝎為鉗蝎科動物東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥體[1]143，主要活性成分為蝎毒，其毒性強烈，若服用不當，會出現一系列不良反應。因此，臨床使用時需進行合理的藥物配伍，進而降低全蝎的毒性，最大程度發揮其藥效。《醫宗金鑒》認為可用全蝎、僵蠶為醒脾湯化痰治標，更用人參、茯苓、白術溫補中氣，恢復脾氣健運，助化痰祛邪，使邪去而不傷正。白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水功效[1]103。王彥多等[2]將攻毒散結的全蝎與健脾益氣的白術相配伍，發現球孢白僵菌發酵的全蝎白術混合發酵品（SAHFP）提取液具有顯著的抗腫瘤作用。據此，本實驗對有效部位進行探討，以期通過超濾分段分離SAHFP中有效成分，進一步明確抗腫瘤活性部位，為該藥物成分及其他中藥配伍研究提供參考。

1? 實驗材料

1.1? 藥材和菌種

全蝎，購自山東臨沂沂水;白術，購自河北安國藥材市場，經山東中醫藥大學高德民副教授鑒定分別為鉗蝎科動物東亞鉗蝎的干燥體和菊科植物白術的干燥根莖。菌種為山東省農業科學院植物保護研究所自篩菌株[桃5（球孢白僵菌）Beauveria bassiana（Bals.）Vuill]。

1.2? 主要試劑與儀器

1640細胞培養基（Hylcone-賽默飛世爾生物制品北京有限公司），牛血清蛋白，胰酶細胞消化液;Folin-酚試劑（國藥集團化學試劑有限公司），無水乙醇、苯酚、濃硫酸、酒石酸鉀鈉等均為分析純。KQ-500GVDV型雙頻恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），WT600-2J型超濾儀（上海摩速科學器材有限公司），DNM-9602酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司），LGJ-18A型冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠有限公司）。

1.3? 細胞株

乳腺癌MCF-7細胞株和喉癌Hep-2細胞株，均由山東省立醫院提供。

2? 實驗方法

2.1? 全蝎白術混合發酵品制備

白僵菌菌種制備：用接種針取桃5（球孢白僵菌）活化菌種適量，無菌接種至PDA培養基，培養7 d，將第2代菌種用蒸餾水稀釋成含有1×108個孢子/mL白僵菌孢子的混懸液備用。

SAHFP制備：全蝎粉、白術粉按1∶1比例混合，加白僵菌孢子混懸液適量潤濕，攪拌均勻，溫度25 ℃、濕度95%以上環境，自然光照，發酵7 d，長滿菌絲后停止發酵，取出冷凍干燥，得凍干粉備用。

2.2? 全蝎白術混合發酵品水提液制備

精密稱取1.000 0 g SAHFP置于100 mL具塞錐形瓶，按雙指標優化工藝中最優提取條件進行提取[3]，重復提取2次，離心、抽濾，得濾液備用，未發酵的全蝎白術混合品同法處理作為對照。

2.3? 水提液醇沉

將“2.2”項下得到的濾液進行醇沉[3]，使成80%醇溶液，密封，置于4 ℃冰箱，靜置過夜。將得到的醇溶液過濾，回收上清液中乙醇，并冷凍干燥，得上清液凍干粉。分離的沉淀物用一定比例蒸餾水溶解，過濾，除去不溶于水物質，再用8 μm濾膜進行抽濾，除去大分子硬顆粒物，得到待超濾液。未發酵混合品的超濾水提液同以上步驟。

2.4? 待超濾液分段

在0.5～1.0 MPa壓力范圍內用蒸餾水沖洗10 kD和5 kD超濾膜各20 min，再對待超濾液進行超濾分段，循環多次，分別得到分子量段>10 kD、5～10 kD和<5 kD的溶液，將3組分子量段溶液進行冷凍干燥，得到不同分子量段凍干粉備用。

2.5? 蛋白質和多糖含量測定

采用改良Lorry法測定蛋白質含量[4]，牛血清蛋白標準曲線回歸方程為Y=0.002 4X+0.010 4，r=0.999 2。稱取一定量“2.3”“2.4”項獲得的凍干粉，加水溶解，于650 nm波長處測定不同分子量段的吸光度，根據回歸方程計算不同分子量段蛋白質得率。

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，得到多糖標準曲線回歸方程為Y=0.016 1X-0.002 4，r=0.999 7。稱取一定量“2.3”“2.4”項獲得的凍干粉，加水溶解，于490 nm波長處測定不同分子量段的吸光度，根據回歸方程計算不同分子量段多糖得率。

2.6? 體外抗腫瘤實驗

2.6.1? 溶液配制

稱取不同分子量段凍干粉各10 mg，溶于5 mL 1640細胞培養基中，配成初始濃度為2 mg/mL的溶液，無菌條件下0.22 μm濾膜過濾，然后用1640細胞培養基逐步稀釋，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL濃度溶液。

2.6.2? MTT法檢測

將處于對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞、喉癌Hep-2細胞胰酶消化，加入1640細胞培養基稀釋至細胞濃度為1×106/mL，以每孔100 μL接種到96孔培養板中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養。24 h后，棄去上清液，每孔加入配好的藥物溶液100 μL，每個濃度設5個復孔，陰性對照組加入不含血清的1640細胞培養基100 μL，陽性對照組加入100 μg/mL順鉑100 μL，放入培養箱中繼續培養。24 h后，每孔避光加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，放入培養箱中反應4 h。吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO，搖勻，于酶標儀492 nm處測定OD值，并計算不同分子量段對腫瘤（乳腺癌、喉癌）細胞的抑制率。

3? 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 發酵前后不同分子量段凍干粉蛋白質、多糖得率比較

SAHFP中蛋白質主要集中在醇沉上清液中，而多糖集中于分子量段>10 kD藥液中，見表1。該分子量段藥液中多糖并非全部來自白術，全蝎中也有部分多糖如酸性黏多糖等，并且在真菌生長過程中產生了許多次生代謝物質如聚酮類物質，主要為大分子物質。

4.2? 不同分子量段凍干粉對乳腺癌MCF-7細胞抑制率的影響

0.3、0.4 mg/mL SAHFP和未發酵品對乳腺癌MCF-7細胞抑制率有顯著差異，而0.5 mg/mL SAHFP和未發酵品對乳腺癌MCF-7細胞抑制率無明顯差異;SAHFP和未發酵醇沉上清液對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率隨濃度的升高而升高，但未發酵上清液抑制率均低于SAHFP的抑制率。見圖1A。SAHFP和分子量段>10 kD未發酵品對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率有顯著差異;分子量段>10 kD SAHFP對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率均高于分子量段>10 kD未發酵品，可明顯看出在該分子量段發酵品對腫瘤的抑制效果高于未發酵品。見圖1B。分子量段5～10 kD SAHFP和未發酵品對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率有顯著差異，分子量段5～10 kD SAHFP和未發酵品無抑制腫瘤細胞生長的作用;分子量段5～10 kD未發酵品濃度達0.8 mg/mL和1.0 mg/mL時對腫瘤細胞有抑制作用，但抑制率較低，均未超過10%。見圖1C。

4.3? 不同分子量段凍干粉對喉癌Hep-2細胞抑制率的影響

SAHFP和未發酵品醇沉上清液對喉癌Hep-2細胞抑制率有顯著差異;在一定濃度下，兩者對腫瘤細胞均具有抑制作用，且SAHFP的抑制效果更顯著。見圖2A。分子量段>10 kD SAHFP和未發酵品對喉癌Hep-2細胞抑制率有顯著差異，SAHFP對腫瘤細胞抑制效果遠高于未發酵品，且SAHFP對腫瘤細胞抑制率隨濃度的升高而升高。見圖2B。分子量段5～10 kD SAHFP和未發酵品對喉癌Hep-2細胞生長有促進作用，二者差異顯著;但對腫瘤細胞均無抑制效果。見圖2C。

5? 討論

由表1可知，通過微生物發酵技術，SAHFP與未發酵品比較，總蛋白質含量減少，多糖含量增加;通過超濾后各分子量段蛋白質含量研究發現，SAHFP中蛋白質主要集中在醇沉上清液中，而未發酵混合品醇沉上清液中蛋白質含量較少，說明在微生物發酵過程中，大分子蛋白被酶解為小分子蛋白和肽類，因為一般通過80%乙醇沉淀，小分子肽類能溶于其中，而大分子蛋白質則因為水化層破壞而沉淀析出。對多糖而言，分子量段>10 kD藥液中多糖含量明顯高于醇沉上清液中多糖含量，且SAHFP多糖含量比未發酵品高，說明白僵菌中其他物質（氨基酸、脂肪酸等）通過特定的途徑（糖異生等）合成大量的多糖類物質。

通過對2組腫瘤細胞抑制率分析發現，SAHFP對腫瘤細胞的抑制效果均高于未發酵品，且醇沉上清液的抑制效果最為明顯;分子量段>10 kD SAHFP，對腫瘤細胞抑制率隨濃度的升高而逐漸升高，而未發酵品則表現出相反的作用效果，對腫瘤細胞的生長具有一定的促進作用。總之，通過微生物發酵，可顯著增強體外抗腫瘤細胞株的作用。

蝎毒作為全蝎藥理作用的主要有效成分，分子量在6000～9000 D，但也有3000 D或大于10 000 D，同時蝎毒具有蛋白質的通性，易被乙醇溶液沉淀，沉淀物可再復溶于水[5]。多糖也屬于生物大分子，可通過乙醇沉淀析出。侯軒等[6]通過凝膠滲透色譜法測定白術多糖的分子量為4360 D，同時白術多糖可促進人胃癌細胞的凋亡[7]。本實驗選擇80%醇溶液進行醇沉，得到的沉淀物以多糖和蛋白質為主，超濾膜選擇截流量為5 kD和10 kD兩種，對SAHFP和未發酵品進行雙重超濾分段，從而對抗腫瘤的活性部位進行了可靠的判定。

中藥提取液進行醇沉，不僅可除去一些雜質，還使一部分有效成分流失，故一定要緩慢加入乙醇，快速攪動藥液，避免局部醇濃度過大，造成有效成分的損失;醇沉后的上清液不能隨意舍棄，應一并進行體外抗腫瘤實驗比較。

綜上，本實驗研究表明，醇沉上清液中小分子物質對乳腺癌MCF-7細胞、喉癌Hep-2細胞均具有顯著的抑制效果，該物質沒有因發酵而被破壞，而且通過發酵，SAHFP對腫瘤細胞抑制作用顯著增強，尤其是分子量段>10 kD的物質發酵后抑制效果遠遠高于未發酵品，說明發酵過程會增強全蝎、白術兩者對腫瘤細胞的抑制作用。本研究主要觀察全蝎白術配伍增加抗腫瘤的效果，未涉及全蝎白術配伍減輕毒性的研究，這是今后深入研究的重點。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 王彥多，劉穎，桑曉，等.雙指標優化全蝎白術混合發酵品水提工藝及抗腫瘤試驗研究[J].中南藥學，2018，16（7）：978-981.

[3] 孫玉琦，劉曉娟，代春美，等.中藥醇沉技術應用與評價[J].中成藥， 2010，32（11）：1961-1963.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：三部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：440-441.

[5] 羅躍，彭延古，易小明.全蝎的化學成分及其作用的研究進展[J].湖南中醫藥大學學報，2008，28（3）：78-80.

[6] 侯軒，周家容，田允波.白術多糖的提取、分離純化及分子量的測定[J].仲愷農業工程學院學報，2009，22（2）：18-21，30.

[7] 王鶴，陳擁軍，張中華.白術多糖對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響[J].中國民族民間醫藥，2015，24（24）：10-11.

（收稿日期：2018-12-14）