雙丹明目膠囊抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖有效成分篩選研究

趙洪慶 符超君 孟盼 王宇紅 秦裕輝 張秀麗

摘要：目的? 從雙丹明目膠囊24個(gè)入血成分中篩選出抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的有效成分。方法? 將雙丹明目膠囊24個(gè)入血成分標(biāo)準(zhǔn)品均稀釋成終濃度為1、10、100 μg/mL的溶液，分別干預(yù)體外培養(yǎng)的HUVEC，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，對(duì)各成分進(jìn)行初篩，再對(duì)有效成分進(jìn)行濃度細(xì)化，確定有效成分的最佳作用濃度。在此基礎(chǔ)上，采用Hoechst33258熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各有效成分對(duì)HUVEC凋亡的影響。結(jié)果? MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，雙丹明目膠囊24個(gè)入血成分中4個(gè)成分能有效抑制HUVEC增殖（P<0.05），分別為3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷，其最佳作用濃度分別為75、75、50、75 μg/mL;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上述4個(gè)成分均能使HUVEC細(xì)胞核固縮、碎裂，數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05），其中以丹參酮ⅡA和芹菜素效果尤為明顯。結(jié)論? 3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷是雙丹明目膠囊抑制HUVEC增殖、發(fā)揮治療糖尿病視網(wǎng)膜病變療效的有效成分。

關(guān)鍵詞：雙丹明目膠囊;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;增殖;有效成分篩選;芹菜素;丹參酮ⅡA

中圖分類號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）07-0048-04

Abstract： Objective To screen out the effective components inhibiting the proliferation of human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） from 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules. Methods All the 24 standards were diluted to a final concentration of 1， 10， and 100 μg/mL， and the HUVEC were cultured in vitro. The cell proliferation inhibition rate was measured by MTT method， and the components were screened. Concentration refinement was used to determine the optimal concentration of effective components. Hoechst33258 fluorescence staining and flow cytometry were used to detect the effects of various effective components on apoptosis of HUVEC. Results The results of MTT experiment showed that among the 24 blood components of Shuangdan Mingmu Capsules， 4 components could effectively inhibit the proliferation of HUVEC （P<0.05）， that were 3-acetate oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin， and the optimal concentrations were 75， 75， 50， and 75 μg/mL， respectively. Further studies found that the above four components could make the nucleus of HUVEC pyknosis， fragmentation， number decreased， and the apoptotic rate increased significantly （P<0.05）， especially the effect of tanshinone ⅡA and apigenin. Conclusion 3-acetyl oleanolic acid， tanshinone ⅡA， apigenin and cosmosin are effective components of Shuangdan Mingmu Capsules for inhibiting the proliferation of HUVEC and treating diabetic retinopathy.

Keywords： Shuangdan Mingmu Capsules; HUVEC; proliferation; screening of effective components; apigenin; tanshinone ⅡA

視網(wǎng)膜病變是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率高且危害性大，目前尚缺乏有效藥物能完全控制其發(fā)生發(fā)展。雙丹明目膠囊主治肝腎陰虛、瘀血阻絡(luò)所致的糖尿病視網(wǎng)膜病變。前期臨床和基礎(chǔ)研究均表明，雙丹明目膠囊能有效改善糖尿病視網(wǎng)膜病變疾病下血糖血脂紊亂，糾正血液流變異常狀態(tài)，降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)，抑制新血管生成[1-3]。在此基礎(chǔ)上，本課題組對(duì)雙丹明目膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，共從該復(fù)方中鑒定出102個(gè)化學(xué)成分及24個(gè)主要的入血成分[4-5]。而其中究竟哪些成分發(fā)揮著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制微血管生成的功效，尚未明確。本研究在前期基礎(chǔ)上，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為研究對(duì)象，通過采用不同濃度的24個(gè)入血成分標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行干預(yù)，篩選出雙丹明目膠囊的有效成分及作用濃度，以期為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、確定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、闡明體內(nèi)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 藥物和細(xì)胞株

所有標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，于使用前用甲醇溶解，并用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。HUVEC購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2? 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶，美國(guó)Gibco公司;MTT粉末，上海碧云天生物技術(shù)研究所。CO2培養(yǎng)箱、MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司;5417R低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)，美國(guó)PerkinElmer公司;流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

1.3? 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)，每隔2～3 d胰酶消化并傳代，定時(shí)更換培養(yǎng)液。

1.4? MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度，8000個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液。配制不同終濃度待測(cè)組分溶液，藥物組每孔加100 μL，同時(shí)設(shè)置空白組（調(diào)零組）和對(duì)照組，空白組除不加細(xì)胞懸液外其余同藥物組，對(duì)照組每孔加100 μL培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT液，避光孵育4 h后，每孔加入DMSO液150 μL，室溫振蕩10 min，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率[（A藥物組-A空白組）÷（A對(duì)照組-A空白組）]，以每板對(duì)照組細(xì)胞存活率為1。

1.5? Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度，8000個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液。加入藥物干預(yù)24 h后，取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，加入PBS洗滌3次，然后每孔加入Hoechst33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min;孵育完成后，棄去孔內(nèi)染液，PBS洗2次，采用高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6? 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

藥物干預(yù)完成后，消化HUVEC，每組細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL，1000 r/min離心5 min，去除上層液體，加入PBS洗滌2次。加入適量Annexin V-FITC/PI溶液5 μL，4 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用Cell Quest軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較用方差分析。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2? 結(jié)果

2.1? 雙丹明目膠囊各入血成分對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響

對(duì)雙丹明目膠囊24個(gè)入血成分進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素、大波斯菊苷能有效抑制HUVEC增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），而同來源于丹參中的隱丹參酮和柳杉酚則有明顯促進(jìn)HUVEC增殖的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2? 雙丹明目膠囊抑制HUVEC增殖有效成分的最佳濃度

對(duì)能明顯抑制HUVEC增殖的4個(gè)有效成分進(jìn)行濃度細(xì)化，發(fā)現(xiàn)各成分對(duì)HUVEC增殖的抑制作用與初篩結(jié)果一致，根據(jù)梯度濃度下不同有效成分的細(xì)胞存活率，確定4個(gè)有效成分最佳作用濃度，3-乙酸齊墩果酸為75 μg/mL，丹參酮ⅡA為75 μg/mL，芹菜素為50 μg/mL，大波斯菊苷為75 μg/mL。見表2。

2.3? 雙丹明目膠囊有效成分對(duì)HUVEC凋亡形態(tài)的影響

Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組HUVEC細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，分布均勻，熒光呈暗藍(lán)色，無明顯的凋亡特征;經(jīng)雙丹明目膠囊中有效成分3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素及大波斯菊苷干預(yù)后，同一視野下細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞分布散亂，部分細(xì)胞核碎裂，呈透亮狀，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征。見圖1。

2.4? 雙丹明目膠囊有效成分對(duì)HUVEC凋亡率影響

對(duì)照組HUVEC凋亡率僅為0.97%，雙丹明目膠囊各有效成分干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率均顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中，丹參酮ⅡA和芹菜素誘導(dǎo)HUVEC凋亡能力明顯更強(qiáng)，平均凋亡率分別為26.63%、28.31%。見圖2、表3。

3? 討論

雙丹明目膠囊是基于糖尿病視網(wǎng)膜病變之“肝腎陰虛、瘀血阻絡(luò)”病機(jī)而成方，由女貞子、墨旱蓮、丹參、三七、山萸肉、山藥、牡丹皮、茯苓、紅土茯苓、澤瀉、牛膝11味中藥組成。方中女貞子、墨旱蓮滋補(bǔ)肝腎、明目，為君藥;丹參、三七活血養(yǎng)血、化瘀通絡(luò)，山萸肉、山藥補(bǔ)腎養(yǎng)肝、健脾固精，四者共為臣藥;牡丹皮、茯苓、紅土茯苓、澤瀉清肝瀉火、利水消腫，共為佐藥;牛膝活血逐瘀、強(qiáng)筋壯骨且性善下行，可防血?dú)馍夏妫瑸槭顾帯ＶT藥合用，共奏益腎養(yǎng)肝、活血明目之功效。

抑制視網(wǎng)膜新生血管生成是治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)鍵，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、芽生、游走又是血管新生的基礎(chǔ)[6]。HUVEC來源于人臍靜脈，是一種具有干細(xì)胞潛能的內(nèi)皮細(xì)胞，抑制HUVEC增殖意味著能減少或阻止新血管的生成，從而能改善糖尿病并發(fā)的視網(wǎng)膜、心血管病變等[7]。通過對(duì)雙丹明目膠囊24個(gè)入血成分文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，僅有芹菜素被報(bào)道抑制HUVEC增殖的作用[8-9]。本研究每個(gè)成分標(biāo)準(zhǔn)品均配制成低、中、高3個(gè)濃度，經(jīng)MTT檢測(cè)反復(fù)篩選，確定3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷4個(gè)成分有明顯抑制HUVEC增殖作用，然后對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行多濃度摸索，確定了4個(gè)有效成分抑制HUVEC增殖的最佳作用濃度。此外，通過Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，上述4個(gè)成分均能誘使HUVEC呈凋亡形態(tài)，增加其凋亡率，并以丹參酮ⅡA和芹菜素抑制效果最為明顯。

綜上，本研究確定3-乙酸齊墩果酸、丹參酮ⅡA、芹菜素和大波斯菊苷是雙丹明目膠囊發(fā)揮治療糖尿病視網(wǎng)膜病變功效的有效成分，其中3-乙酸齊墩果酸和芹菜素來自君藥墨旱蓮，大波斯菊苷來自君藥女貞子，丹參酮ⅡA則來自臣藥丹參。本研究確定了雙丹明目膠囊藥效成分，為其質(zhì)量控制研究提供了依據(jù)。

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