珠子草藥材質量標準及HPLC指紋圖譜研究

潘新波 王信 薩日娜 李彩東 張偉

摘要：目的? 建立珠子草藥材的質量標準及HPLC指紋圖譜，探討不同產地珠子草藥材成分的差異性。方法? 分別從性狀、鑒別、檢查和浸出物、含量測定方面對珠子草藥材的質量標準進行研究。采用ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，柱溫25 ℃，檢測波長270 nm，流速1.0 mL/min，進樣量10 ?L，對10個不同產地珠子草藥材進行測定;采用相似度分析和主成分分析對指紋圖譜進行評價。結果? 擬定了珠子草藥材質量標準草案，建立了10個不同產地珠子草藥材的HPLC指紋圖譜，確定了8個共有峰，指認了短葉蘇木酚和柯里拉京2個特征峰。不同產地珠子草的化學成分組成及含量存在一定差異，其中柯里拉京可作為區別產地的特征性物質。結論? 本研究建立的定性定量檢測方法操作簡便、準確可靠、專屬性強、重復性好，可作為珠子草藥材的質量控制方法;建立的珠子草HPLC指紋圖譜可為該藥材的鑒別及質量控制提供參考。

關鍵詞：珠子草;質量標準;高效液相色譜法;指紋圖譜;相似度分析;主成分分析

中圖分類號：R282??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0066-07

Abstract： Objective To establish the quality standards and HPLC fingerprints of Phyllanthus niruri Linn.; To study the differences in the components of Phyllanthus niruri Linn. from different producing areas. Methods The quality standards of Phyllanthus niruri Linn. was studied from characters， identification， inspection with extract， and content determination. The HPLC separation was performed on ZORBAX Eclipse plus C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid water in gradient elution; the column temperature was 25 ℃; the detection wavelength was 270 nm; the flow rate was 1.0 mL/min; the sample volume was 10 ?L. Phyllanthus niruri Linn. from ten different producing areas were determined; similarity analysis and principal component analysis were used to analyze the fingerprints. Results The quality standard of Phyllanthus niruri Linn. was drafted. The HPLC fingerprints of Phyllanthus niruri Linn. from ten different producing areas were established with eight common peaks， and two characteristic peaks included brevifolincarboxylic acid and corilagin were confirmed. There were some differences in the chemical components and content of Phyllanthus niruri Linn. from different producing areas， of which corilagin could be used as the characteristic material to distinguish the difference of producing areas. Conclusion The qualitative and quantitative determination method is simple， accurate and reliable， with good stability and reproducibility， which can be used for the quality control of Phyllanthus niruri Linn. The established HPLC fingerprints can be used for the identification and quality control of Phyllanthus niruri Linn.

Keywords： Phyllanthus niruri Linn.; quality standards; HPLC; fingerprints; similarity analysis; principal component analysis

珠子草Phyllanthus niruri Linn.為大戟科葉下珠屬植物，又名月下珠、小返魂、霸貝菜，全草入藥，是印度與我國的傳統民間草藥，具有平肝清熱、利水解毒功效，臨床用于治療肝炎、腸炎、尿路感染、無名腫痛及糖尿病等[1-2]。研究顯示，珠子草主要活性成分為多酚類及木脂素類，其中多酚類包括柯里拉京、沒食子酸和鞣花酸等[3-4]。迄今對珠子草藥材的基礎研究主要集中在化學成分、藥理作用及機制方面，臨床研究主要集中在抗乙肝病毒、改善肝功能和抗肝細胞纖維化等方面[5-7]，而針對珠子草有效成分含量、質量綜合評價與控制的研究相對較少，限制了珠子草藥材的應用和開發。珠子草曾收載于地方標準2005年版《云南省中藥材標準》，只有簡單的性狀描述等，質量標準不完善。為了更好開發利用珠子草，合理評價和控制該藥材的質量，對其質量標準進行提高和系統性研究尤為必要。

本課題組前期對珠子草藥材進行了生藥學鑒別研究[8]，基于此，本試驗依據2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）中藥質量標準研究制定技術要求，對珠子草藥材進行深入的質量標準研究，并建立10個不同產地的珠子草藥材HPLC指紋圖譜，進行相似度分析和主成分分析，比較不同產地珠子草藥材HPLC成分差異性，為更好地控制珠子草藥材質量提供依據。

1? 儀器與試藥

美國Agilent 1260高效液相色譜儀（四元梯度泵，DAD檢測器，OpenLAB色譜工作站），XPE105十萬分之一電子分析天平（梅特勒托利多公司），KH-100E超聲波提取器（昆山禾創超聲儀器有限公司），BX51生物顯微鏡（日本Olympus公司），WH-43電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），TDW箱式電阻爐（上海東星建材試驗有限公司），XMTD-204恒溫水浴鍋（江蘇新康醫療器械有限公司）。

短葉蘇木酚對照品（德爾塔林試劑公司，批號18490-0805，純度≥98%），柯里拉京對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111623-200302，純度≥98%），鞣花酸對照品（天津一方科技有限公司，批號00597，純度≥97%），珠子草對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號121319-200301），乙醇（分析純，天津市紅巖化學試劑廠），鹽酸（分析純，北京化工廠），磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司），甲醇（色譜純，深圳西隴化工股份有限公司），薄層硅膠G板（青島海洋化工集團公司），水為超純水，其他試劑均為分析純，無灰濾紙（杭州特種紙業有限公司）。10個不同產地珠子草藥材樣品來源見表1，經西北師范大學王慶瑞教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物珠子草Phyllanthus niruri Linn.的全草。

2? 方法與結果

2.1? 性狀

本品長短不一，高20～70 cm，根外表棕色至紅棕色，直徑2～6 mm，有縱紋，質硬、脆易折，折斷面棕色至灰綠色;主根不發達，須根多數，淺灰棕色。莖圓柱形，略帶褐紅色，直徑1～4.5 mm，有縱皺紋，體輕，質脆，易折斷，斷面灰綠色，髓部中空。單葉互生，葉片紙質，長圓形，長約4～10 mm，寬約2～4.5 mm，葉柄極短，托葉披針形?；毿?，腋生于葉背之下。蒴果扁圓形或略呈圓三角形，直徑1～1.5 cm，紅褐色，平滑無毛，軸柱及花萼均宿存;種子6枚，三角狀卵形，淡黃色或灰黃色，背側為上下縱紋，側面為同心圓狀紋理。以葉多、青綠色者為佳。氣微香，味苦。

2.2? 鑒別

2.2.1 ?顯微鑒別

根橫切面：表皮為3～4列長方形細胞，切向排列。皮層較寬，少有裂隙，由數列疏松的薄壁細胞組成。韌皮部狹窄，呈環帶狀，韌皮射線不明顯，篩管散列，內含黃棕色分泌物。形成層呈環狀，為一列扁平細胞。初生木質部導管較集中，次生導管稀疏略呈放射狀排列，射線細胞1～2列徑向延長，導管多角形，直徑8.4～39.0 ?m。木質部寬廣，木射線密集，由1～2列細胞組成，射線間嵌有導管、木纖維及木薄壁細胞，導管單個或2～7個徑向相聚成群、呈放射狀排列，外側常有木纖維嵌于導管群間，薄壁細胞含淀粉粒。

莖橫切面：表皮3～4列細胞，類方形，常脫落。皮層5～7列類圓形、矩圓形細胞，排列較疏松。韌皮部約6列類圓形、類多角形細胞，篩管內充滿分泌物。形成層為一列小型細胞，環狀排列。木質部寬廣，導管稀疏，木射線明顯。薄壁細胞呈環狀分布，木質部纖維發達，壁極厚，胞腔狹小。射線細密，1～3列長方形細胞徑向延長。髓部薄壁細胞類圓形，排列疏松，髓中央常呈空腔。

粉末特征：全草粉末灰綠色，味苦。木纖維常成束，黃色或淡黃色，斷端平截或縱成帚狀，直徑7.8～18.2 ?m，長80.6～447.2 ?m。草酸鈣簇晶散在或存在于葉肉組織中，直徑10.4～28.6 ?m;草酸鈣方晶眾多，不規則，呈四面體、錐形、斧形等，直徑5.2～26 ?m。葉上下表皮細胞多角形，周壁彎曲，下表皮氣孔密集，氣孔不定式或不等式，副衛細胞3～4個。淀粉粒單粒，稀復粒，類圓形，臍點裂縫狀、人字狀等，大小不一，直徑5.2～18.2 ?m[8]。

2.2.2? 薄層鑒別

取本品粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲（功率800 W，頻率50 kHz）處理10 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取珠子草對照藥材粉末1 g，照供試品溶液制備方法制成珠子草對照藥材溶液。照薄層色譜法（2015年版《中華人民共和國藥典》通則0502）試驗，依次吸取對照藥材溶液和供試品溶液各10 ?L，分別點于同一硅膠G板上，以環己烷-氯仿-乙酸乙酯-冰乙酸（5∶1∶1∶0.1）為溶劑上行展開，取出，揮干溶劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖1。

2.3? 檢查和浸出物

2.3.1? 雜質

按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2301雜質檢查法，取供試品約5 g，稱定質量，用肉眼或借助放大鏡（5～10倍）觀察，將雜質（泥土、其他等）揀出;如其中有可以篩分的雜質，則通過適當的篩，將雜質分出。將各類雜質分別稱重，計算，結果見表2。10個不同產地珠子草藥材樣品雜質含量在2.02～3.10%之間，應將其雜質標準在其平均值2.41%的基礎上上浮20%，故將雜質含量暫定為不得超過3.0%。

2.3.2? 水分、灰分及浸出物

按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0832第二法烘干法測定水分;按通則2302灰分測定法測定總灰分和酸不溶性灰分;按通則2201浸出物測定法冷浸法，用乙醇作溶劑，測定醇溶性浸出物。結果見表3。

2.4? 含量測定

2.4.1? 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，3%～15%A;20～45 min，15%～28%A;45～60 min，28%～45%A）;流速：1 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測波長：270 nm;進樣量：10 ?L。

2.4.2? 混合對照品溶液的制備

分別取鞣花酸、短葉蘇木酚及柯里拉京對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL分別含鞣花酸0.046 8 mg、短葉蘇木酚0.028 8 mg和柯里拉京0.045 2 mg的混合對照品溶液，置于4 ℃避光保存備用。

2.4.3? 供試品溶液的制備

取本品粉末（過2號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL溶解，稱定質量，超聲（功率800 W，頻率50 kHz）提取30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.5? 方法學考察

2.5.1? 精密度試驗

精密吸取6號供試品溶液10 ?L，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以柯里拉京為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果相對保留時間RSD<0.25%，相對峰面積RSD<3.75%，表明儀器精密度良好。

2.5.2? 重復性試驗

精密稱取同一批珠子草樣品（6號）粉末6份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 ?L，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣測定，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果相對保留時間RSD<0.64%，相對峰面積RSD<2.17%，表明該方法重復性良好。

2.5.3? 穩定性試驗

取6號供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別于制備后0、4、8、12、24 h進樣測定，結果相對保留時間RSD<0.31%，相對峰面積RSD<2.58%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.6? 指紋圖譜的建立與相似度分析

取10個不同產地珠子草樣品，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）》軟件，以S6樣品色譜圖為參照譜圖，多點校正后經自動匹配，中位數法生成樣品疊加色譜圖（見圖2）和共有模式（見圖3）。通過供試品與對照品色譜峰相對保留時間及紫外吸收譜圖比對，確定4號峰為短葉蘇木酚，5號峰為柯里拉京。

2.7? 主成分分析

以10個不同產地珠子草樣品HPLC圖譜的全時段檢測信號為原始數據，通過數學組合，生成一個9000×10的矩陣，矩陣的列代表不同產地的珠子草樣品。將此矩陣導入SPSS19.0軟件，進行主成分分析，結果見表4、表5。以10個不同產地珠子草樣品HPLC圖譜數據集的前3個特征主成分（PC1、PC2、PC3）作投影，分析結果見圖4。

2.8? 含量測定

2.8.1? 線性關系考察

分別精密吸取“2.4.2”項下混合對照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 ?L，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸的回歸方程分別為Y=138.444X-37.799（r=0.999 6）、Y=84.837 9X-10.874（r=0.999 2）、Y=122.9X+13.29（r=0.999 5），分別在0.057 6～0.576 ?g、0.090 4～0.904 ?g和0.093 6～0.936 ?g范圍內線性關系良好。

2.8.2? 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液各10 ?L，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以混合對照品峰面積積分值計算，短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸色譜峰的峰面積RSD分別為1.40%、1.72%和1.39%，結果表明儀器精密度良好。

2.8.3? 重復性試驗

精密稱取同一批珠子草樣品（6號）粉末6份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 ?L，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣測定，短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸色譜峰的峰面積RSD分別為0.64%、1.52%和0.13%，結果表明該方法重復性良好。

2.8.4? 穩定性試驗

取6號供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別于制備后0、4、8、12、24 h進樣測定，短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸色譜峰的峰面積RSD分別為2.49%、1.24%和1.31%，結果表明在室溫條件下該供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.8.5? 加樣回收率試驗

精密稱定9份已知含量的珠子草樣品粉末（6號），每份1.0 g，平均分為3組，按“2.4.3”項下方法制備低、中、高濃度的供試品溶液，分別精密吸取10 ?L，注入高效液相色譜儀，以外標法進行測定，每個濃度測定3次，結果見表6。

2.8.6? 樣品測定

將10個不同產地珠子草樣品按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣測定，每批平行測定3份，分別計算樣品中短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸的含量，結果見表7。

3? 討論

本研究分別從性狀、鑒別、檢查和浸出物、含量測定四方面對珠子草藥材的質量標準進行研究，所建立的珠子草薄層色譜定性鑒別和指標成分（短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸）含量HPLC同時測定方法操作簡便、重復性好、專屬性強，可用于該藥材的質量控制和評價。

本研究以10個不同產地珠子草藥材為對象，建立了珠子草HPLC指紋圖譜，確定了8個共有峰，以對照品色譜圖指認了其中2個色譜峰，分別為短葉蘇木酚和柯里拉京。相似度評價結果表明，不同產地珠子草藥材中化學成分存在的差異性與其產地具有一定的相關性。

主成分分析作為一種無監督模式識別法，利用降維思想，將多個變量簡化為幾個綜合變量，最大限度保留原樣本集所含的原始信息，建立的新變量為原變量的線性組合，尋求主成分，以達到數據的壓縮和解釋目的[9]。不同產地珠子草中化學成分組成及含量存在一定差異，主成分分析結果與樣品地理分布結果吻合度較高，且與HPLC指紋圖譜相似度評價結果及薄層鑒別結果也較為相似，能夠反映出不同產地珠子草化學成分的差異性和相似性。此外，在所識別篩選出的6個用于區別產地差異的特征性物質中指認柯里拉京，初步推測其可作為區別產地差異的特征性物質。從本研究結果可以初步得出，不同產地珠子草中化學成分與其所在產地具有相關性，其原因可能與產地的氣候、土壤等環境條件有關，具體還需進一步研究。

總之，本研究建立了同時測定珠子草中短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸的HPLC方法，對不同產地珠子草樣品進行測定。通過對測定結果進一步對比研究發現，不同產地珠子草中短葉蘇木酚、柯里拉京和鞣花酸的含量差異較大，有同一省份珠子草中上述3種成分含量較為相似者，如1號和4號（云南景洪和云南個舊）;也有地理位置較為相近但3種成分含量差異較大者，如6號和7號樣品（甘肅省隴南市武都和陳縣），以及4號和5號樣品（云南個舊與云南蠻耗）。這一研究結果與主成分分析結果較為相似，從而進一步論證了化學模式識別技術（如主成分分析）可用于區別珠子草的來源（產地）。

本研究補充完善并擬定了珠子草質量標準草案，利用常規指紋圖譜數據分析方法結合主成分分析對不同產地珠子草藥材進行評價，可為建立珠子草藥材整體性質量評價體系提供基礎和依據。

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