達氏鱘dmc1基因的克隆及在精子生成中的表達分析

向 浩，葉 歡，李創舉，楊俊琳，3，厲 萍，杜 浩，危起偉

（1.華中農業大學水產學院，湖北武漢 430070；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室，湖北武漢 430223；3.中國科學院水生生物研究所，湖北武漢 430072）

Dmc1最早發現于酵母中，是大腸桿菌（Escherichia coli）RecA 蛋 白 的 同 源 蛋 白［1］。RecA蛋白的另一個同源蛋白Rad51除了在減數分裂中起重要作用外，還參與有絲分裂重組DNA的修復。Dmc1蛋白和Rad51蛋白共同定位于減數分裂前期Ⅰ的偶線期，為同源染色體配對和交叉重組所必需［2］。1996年發現Dmc1蛋白是哺乳動物細胞減數分裂特異的重組蛋白，僅在哺乳動物處于減數分裂過程的生殖細胞中表達。人的Dmc1蛋白與酵母的Dmc1蛋白的同源性為54%，存在大腸桿菌RecA蛋白家族中保守的第二結構域部分，包括兩個ATP結合位點和兩個DNA結合區［3］，表明Dmc1蛋白在進化過程中是高度保守的，同時也反映了Dmc1蛋白結構上的穩定性對生物體功能的重要性。

減數分裂中，染色體的正常分離依賴于合線期同源染色體精確配對形成的二價體，而同源重組和聯會復合體是影響同源染色體配對的主要因素［4-5］。在酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）中，一些減數分裂必需或特異基因如dmc1、rad51和hop1已被克隆［6-8］。研究發現，酵母dmc1基因的突變和敲除都會使減數分裂停滯在偶線期，導致同源染色體聯會失敗，減數分裂細胞內積聚大量的雙鏈斷裂（DSB）重組中間體［9］，表明dmc1在減數分裂的同源染色體配對和交叉重組中起著重要的作用［10］。近年來，不同倍性鯽鯉（Carassius auratus×Cyprinus carpio）［11］、日本鰻鱺 （Anguilla japonica）［12］、 蠑 螈 （Cynops orientalis）［13］、牦牛（Bos grunniens）和犏牛（Bos grunniens × Bos taurus）［14］、小 鼠 （Mus musculus）［3，6］、人（Homo sapiens）［3，6，15］等物種中克隆得到 dmc1的同源基因，而有關達氏鱘（Acipenser dabryanus）dmc1基因的研究尚未見報道。小鼠dmc1基因在減數分裂Ⅰ細線期到偶線期中特異表達，為同源染色體聯會配對所必需。若dmc1突變或者被敲除，會導致減數分裂停滯在偶線期，不會出現同源染色體聯會或在少數非同源染色體之間出現聯會異常［16］；另外，犏牛睪丸組織dmc1基因低水平表達所表現出的減數分裂障礙與小鼠dmc1基因突變和敲除的表型一致，表明睪丸組織dmc1基因的低表達可能與犏牛的雄性不育有一定的關系，進一步說明dmc1在哺乳動物細胞減數分裂的同源重組過程中起著重要的作用［14］。蠑螈dmc1基因在前細線期高水平表達，并一直持續到精子生成階段［13］。日本鰻鱺中發現dmc1基因僅在減數分裂Ⅰ的早期表達［12］，并一直持續到粗線期，但其表達量逐漸減少。在不同倍性鯽鯉中，dmc1基因也只在其早期卵巢或者精巢中特異表達［11］，顯示dmc1基因在減數分裂過程中的功能保守性。

鱘魚類是現存最早的脊椎動物之一，已生存超過2億年，具有重要的進化地位。達氏鱘隸屬鱘形目（Acipenseriformes），鱘科（Acipenseridae），鱘屬，又名沙臘子、長江鱘，純淡水定居性魚類，是長江珍稀瀕危魚類，為國家一級保護動物，對其開展種質資源保護研究具有重要意義。目前有關達氏鱘的研究主要集中在生物形態學［17-18］、種群生態學［19-20］、遺傳學及物種鑒定方面［21］。達氏鱘生殖發育相關分子研究進行了dead end［22］、vasa［23］基因的表達特征和功能分析。本研究利用PCR技術克隆得到達氏鱘dmc1基因的編碼區序列，利用生物信息學方法分析達氏鱘dmc1基因編碼區特征和系統進化關系；并采用RT-PCR分析達氏鱘dmc1基因在其不同組織和不同發育時期精巢的表達特征，以期獲得達氏鱘減數分裂特異標記基因，為達氏鱘初級和次級精母細胞的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及樣品

實驗用魚為全人工繁殖1～3齡的子二代達氏鱘，來自中國水產科學研究院長江水產研究所荊州太湖試驗場。分別取試驗魚心、肝、脾、腎、鰓、腸、垂體、下丘腦、精巢和卵巢等組織，在液氮中速凍后，置于-80℃冰箱保存備用。對于不同發育時期的精巢組織，取一部分用Bouin’s試液固定12～16 h后，置于70%乙醇中4℃保存。

1.2 達氏鱘精巢不同發育時期組織學染色

不同發育時期的達氏鱘精巢組織在Bouin’s試液中固定后經酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋切片，切片的厚度為4μm；用蘇木精-伊紅染色法染色（Carazzi蘇木精、0.2%伊紅水溶液），中性樹膠封片。正置熒光顯微鏡（DM5000B，Leica）觀察并拍照。

1.3 RNA提取及cDNA的制備

使用 RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen，Cat No.74134）試劑盒提取各種組織的總RNA，RNA濃度和純度用核酸測定儀（Nanodrop 2000）測定，并用DNaseⅠ（TaKaRa）消化處理總RNA以消除基因組DNA的殘留，最后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用 PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，Cat No.RR047A）試劑盒合成cDNA第一鏈，操作按照說明書進行。合成的cDNA于-20℃保存備用，用于后續編碼區序列克隆和熒光定量PCR分析。

1.4 達氏鱘dmc1基因編碼區序列的獲得

根據達氏鱘性腺轉錄組數據庫序列設計上、下游引物Dmc1-Fw和Dmc1-Rv（表1），以上述反轉錄獲取的精巢cDNA為模板，擴增出dmc1基因的編碼區序列。PCR擴增體系為25μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板cDNA 1μL，10×PCR Buffer：2.5μL，MgCl2：2.0μL，dNTP：0.5 μL，Taq酶：0.5μL，ddH2O：18.0μL。擴增條件為：94℃變性4 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃1 min 30 s，38 cycles；72℃延伸 10 min。PCR反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收純化目的片段，然后克隆到pMD19-T載體上，16℃連接過夜。連接產物轉化 Trans5α大腸桿菌（Escherichia coli），經 Ampicillin抗性篩選，挑取陽性菌落，擴大培養后進行菌液PCR鑒定，并由上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.5 Dm c1序列分析及系統進化樹構建

將測序所得核苷酸序列在NCBI中BLAST進行同源性比對，使用ORF Finder確定開放閱讀框，并推導其相應的氨基酸序列；利用TMHMMServer 2.0對蛋白的跨膜區域進行預測；使用 Signal P 4.1 Server預測信號肽；ExPASy ProtParam對所推測的蛋白質基本物理化學參數進行分析；采用CLUSTAL X軟件對核苷酸和氨基酸序列進行同源性的比對分析；利用MEGA 7.0軟件中Neighbor-joining方法進行系統進化分析，并進行1 000次自展檢驗（Bootstrap）評估進化樹分支可信度。

1.6 達氏鱘dmc1基因的組織表達特征分析

為分析dmc1基因在2齡達氏鱘雌、雄個體不同組織的表達特征，以各種組織cDNA為模板，用dmc1基因特異引物Dmc1-F1和Dmc1-R1（表1）進行RT-PCR檢測，以β-actin為內參。反應體系：1μL cDNA為模板，上游、下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer：2.5μL，MgCl2：2.0μL，dNTP：0.5μL，Taq酶：0.5μL，ddH2O：18μL。擴增條件為：94℃預變性4 min；94℃ 變性30 s，54℃ 復性30 s，72℃延伸20 s，反應進行35個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 達氏鱘dmc1基因在不同發育時期精巢的表達分析

為驗證設計的定量PCR引物Ad Dmc1-qRT-F和Ad Dmc1-qRT-R（表1）的可行性，以達氏鱘精巢cDNA為模板，用ddH2O做連續10倍梯度稀釋，5個濃度梯度，從1到1∶1×104，每個梯度設置3個重復，進行熒光定量PCR來建立標準曲線。20μL熒光定量PCR體系：模板1μL，熒光定量PCR上、下游引物各0.4μL，2×PowerUpTMSYBR?Green Master Mix 10μL，ddH2O 8.5μL。PCR反應程序：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，57℃退火 15 s，72℃延伸 15 s，讀板溫度 77℃，讀板時間5 s；40次循環，做熔解曲線分析溫度為60～95℃。根據熒光值的變化規律，系統將自動生成標準曲線和熔解曲線。

以上述逆轉錄獲得的達氏鱘不同發育時期的精巢cDNA為模板，采用qRT-PCR技術分析dmc1基因在不同發育時期精巢的表達情況。20 μL PCR反應體系為：2×PowerUpTMSYBR?Green Master Mix 10μL，上、下游引物各0.4μL，ddH2O 8.5μL。PCR反應程序同制作標準曲線進行的熒光定量PCR反應程序。每個樣品設置3個平行，以達氏鱘β-actin為內參，用滅菌雙蒸水代替模板作為陰性對照。應用2-ΔΔCT法確定dmc1基因mRNA表達量，利用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，當P＜0.05時認為差異顯著，P＜0.01時認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 dmc1基因編碼區序列特征分析

獲得達氏鱘Dmc1開放閱讀框（open reading frame，ORF）為 1 029 bp，編碼 342個氨基酸。ExPASy ProtParam分析達氏鱘Dmc1前體蛋白的理化性質，推測達氏鱘 Dmc1的分子式為C2964H4901N1029O1223S255，總共包括10 372個原子，其蛋白質分子量（protein molecular weight，Mr）為82.696 kDa，理論等電點（isoelectric point，pI）為5.04；該蛋白由22種氨基酸組成，其不穩定指數（instability index）為 46.85，屬于不穩定蛋白；親水性平均指數為0.829，屬于疏水性蛋白。

利用SignalP 4.1 Server在線分析，結果顯示該預測蛋白不存在信號肽序列，也未發現跨膜區，表明其不是分泌性蛋白、跨膜蛋白。結構域分析結果顯示：達氏鱘Dmc1蛋白與其它物種一樣都含有大腸桿菌RecA蛋白家族保守的第二結構域（63-342）、Rad51＿DMC1＿radA，B（103-337）結構域和 recomb＿DMC1（26-340）結構域。同時在這些保守區域內還含有兩個嘌呤核苷酸的結合位點（motifs A和B）和兩個DNA結合區（L1和 L2）（圖1）。

表1 PCR相關引物序列Tab.1 Primers used for PCR

圖1 達氏鱘Dm c1氨基酸序列的預測及與其他物種Dm c1氨基酸序列的比較Fig.1 Predicted Dm c1 am ino acid sequence of Acipenser dabryanus and alignment w ith other species

2.2 達氏鱘dmc1基因同源性分析

利用CLUSTAL X分析達氏鱘Dmc1和已經報道的其他物種Dmc1的氨基酸序列同源性。多重比對達氏鱘、日本鰻鱺、尼羅羅非魚、斑馬魚、鯽鯉、青鱂、蠑螈、爪蟾、小鼠和人的Dmc1氨基酸序列（表2），發現在這些物種中，Dmc1氨基酸序列具有較高的同源性，其中任意兩者的同源一致性都在85%以上，并且都含有兩個可以結合核酸motif（GEFRTGKT和 LLIID），這表明 Dmc1蛋白在進化過程中可能比較保守。系統進化分析顯示（圖2），Ad Dmc1屬于RecA家族Dmc1蛋白分支，且屬于四足動物類分支，與硬骨魚類分支分開。

表2 達氏鱘Dm c1氨基酸序列和其他物種的相似性比較Tab.2 Percentage identities in am ino acid sequence of Ad Dm c1 w ith other species

圖2 Dm c1氨基酸序列系統發育樹（達氏鱘Dm c1加粗顯示）Fig.2 Phylogenetic relationship of fish Dm c1 proteins（bold font shows Acipenser dabryanus Dm c1）

2.3 達氏鱘dmc1基因在不同組織中的表達特征

采用RT-PCR方法分析dmc1基因在達氏鱘雌、雄個體9種組織中的表達特征。如圖3所示，在達氏鱘雌雄個體9種組織中，dmc1基因僅在精巢和卵巢中表達；而在心、肝、脾、腎、鰓、腸、垂體和下丘腦中未發現dmc1的表達，表明dmc1基因為達氏鱘性腺特異表達。

2.4 達氏鱘dmc1基因real-time PCR標準曲線的建立

將達氏鱘精巢cDNA模板按10倍倍比稀釋5個濃度梯度，對dmc1基因進行real-time PCR擴增，得到標準曲線、熔解曲線（圖4）并進行分析。可知標準曲線中的拷貝數與CT值兩者基本呈線性反比關系，基因片段回歸方程為：Y=-3.176X+34.531，標準曲線相關系數R2=0.996，表明線性關系良好，擴增效率為106.486%，熔解曲線顯示單一的峰，無非特異性峰，擴增產物單一，無非特異性擴增及引物二聚體形成。符合實驗的要求，可用于后續目的基因片段的定量分析。

2.5 達氏鱘不同發育時期精巢中dmc1基因m RNA的表達水平

根據HE染色結果可將達氏鱘精巢發育分為6個時期：0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期。0期精巢中，未形成精小囊，可見少量原始生殖細胞（圖5-a）；Ⅰ期精巢中，精原細胞增殖，可見大量A型精原細胞（圖5-b）；Ⅱ期精巢中出現B型精原細胞，但主要還是以A型精原細胞為主（圖5-c）；Ⅲ期精巢中，以初級精母細胞為主，存在著少量次級精母細胞（圖5-d）；Ⅳ期精巢中，有大量初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞，還有少量的精子（圖5-e）；Ⅴ期精巢中，主要是精子（圖5-f）。

Real-time PCR結果（圖6）顯示，在0期和 I期的精巢中，dmc1基因沒有表達，Ⅱ期精巢中其有微弱表達；在Ⅲ期和Ⅳ期中其表達量急劇增加，并在Ⅳ期達到最高水平；Ⅴ期精巢中其表達量顯著性降低（P＜0.05）。

圖3 達氏鱘dmc1基因的組織表達特性Fig.3 Tissue-specfic expression of Addmc1

圖4 dmc1基因擴增動力學曲線與熔解曲線Fig.4 Am p lification dynam ics curve and m elting curve of dm c1

圖5 達氏鱘精巢不同發育時期形態結構Fig.5 M orphological structure of testis of Acipenser dabryanus at different development stages

3 討論

本研究成功克隆了達氏鱘dmc1基因的編碼區序列，獲得開放閱讀框（ORF）為1 029bp，編碼342個氨基酸。與其他魚類Dmc1氨基酸序列進行同源性比較，發現達氏鱘Dmc1與青鱂同源性最高，為91.23%，同時與人類、小鼠也具有較高的相似性，分別為92.06%和90.88%。蛋白預測分析表明，達氏鱘Dmc1與其他物種一樣都含有大腸桿菌RecA蛋白家族保守的第二結構域、recomb＿DMC1結構域和Rad51＿DMC1＿radA，B結構域，并且在這些保守區域內還含有兩個嘌呤核苷酸的結合位點（motifs A和 B）［9］和兩個 DNA結合區（L1、L2），其中motif A（GEFRTGKT）是ATP/GTP結合位點，這個motif廣泛存在于Dmc1及同源蛋白、DNA重組與修復蛋白RecA和Rad51中［15］。根據Dmc1的多重序列比對和系統進化分析發現，Ad Dmc1屬于RecA家族Dmc1蛋白分支，且屬于四足動物類分支，與硬骨魚類分支分開，初步認為本研究克隆得到的序列是達氏鱘dmc1基因。

圖6 達氏鱘精巢不同發育時期dmc1基因mRNA的相對表達水平Fig.6 Relativem RNA level of dmc1 gene of testis in Acipenser dabryanus at different development stages

對多種魚類研究發現，dmc1基因在不同組織的表達特征較為保守，即僅在性腺中特異表達。在紅鯽、鯉、四倍體鯽鯉及三倍湘云鯽中［11］，dmc1基因只在其早期卵巢或者精巢中特異表達。在第四代雌核發育二倍體鯽鯉中（G4）［24］中，同樣發現dmc1基因只在G4性腺中表達。本研究通過RTPCR分析發現，達氏鱘dmc1基因也只在性腺中特異表達，說明其可能只在性腺中發揮作用。

在達氏鱘不同發育時期精巢的研究結果表明，dmc1基因在0～Ⅰ期精巢中不表達；在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期精巢中其表達量逐漸升高，并在Ⅳ期精巢中達到最高；在Ⅴ期精巢中，其表達量顯著性下降（P＜0.05）。結合HE染色結果發現，0期精巢中未形成精小囊，可見少量原始生殖細胞；Ⅰ期精巢中精原細胞增殖，可見大量A型精原細胞；Ⅱ期精巢中出現B型精原細胞，但主要還是以A型精原細胞為主；Ⅲ期精巢中，以初級精母細胞為主，存在著少量次級精母細胞；Ⅳ期精巢中，有大量初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞，還有少量的精子；Ⅴ期精巢中，主要是精子，初步推斷dmc1基因主要在精母細胞中表達。這與dmc1基因在小鼠中的表達特征類似，小鼠dmc1基因僅在減數分裂I細線期到偶線期的精母細胞中特異表達［9］。然而，在蠑螈的研究中，發現dmc1基因在減數分裂I細線期開始顯著表達，且一直持續至精子生成階段，即dmc1基因不僅在精母細胞中表達，而且在精子細胞中也表達［13］，這表明dmc1基因可能在單倍體細胞（如精子細胞）中發揮一定的作用，并非僅調控減數分裂過程中染色體的聯會和重組。日本鰻鱺中，dmc1基因只在減數分裂Ⅰ的早期表達［12］，并持續到粗線期，但其表達量逐漸降低。綜上所述，雖然dmc1基因在表達時期存在種間特異性，但其主要在減數分裂過程中起作用。

精子發生是一個復雜的細胞增殖及分化的過程，其中減數分裂又是最為關鍵的步驟。在此過程中，一些基因的存在與否、表達水平對形成具有活性的成熟精子有著至關重要的作用［25］。研究表明，dmc1基因在犏牛睪丸組織中低水平表達所表現出的減數分裂障礙與小鼠dmc1基因突變、敲除的表型一致，表明dmc1基因的低水平表達與犏牛的雄性不育有一定關系［14］，這可能對治療雄性不育提供新思路。在酵母中，dmc1基因的突變導致減數分裂中的DSBs修復大幅減少，出現聯會紊亂。而在人和小鼠的雄性個體中，dmc1基因的突變使聯會紊亂，造成精子生成障礙。與哺乳動物不同，青鱂缺失dmc1基因仍會產生少量畸形精子，暗示青鱂中存在 DSBs修復的補償途徑［26］。dmc1基因作為減數分裂過程中的特異表達基因，能標記生殖細胞進行減數分裂的開始，有助于闡述一些物種從有絲分裂到減數分裂的形態轉變機制［13］。經過十多年的發展，魚類生殖細胞移植技術已成功應用到多種魚類，在種質資源保存、增殖放流和物種恢復方面具有重大的應用潛力。近年來有關達氏鱘精原細胞移植的研究已經取得階段性成果，但高效的移植依賴于精原干細胞的體外增殖培養。前期已開展了達氏鱘精原細胞培養方面的工作，但對培養的達氏鱘精原干細胞鑒定還有所欠缺。目前，已鑒定的達氏鱘生殖細胞標記基因有dnd和vasa，但是它們除了在精原細胞表達外，在精母細胞中也有表達。因此，有必要鑒定在特異類型生殖細胞表達的基因。本研究中dmc1基因在精子生成中所表現出的結果，推斷其可能為減數分裂標記基因，將為后續體外培養精原干細胞的鑒定奠定基礎。