恒河猴和食蟹猴ABO血型競爭性等位基因PCR(KASP)檢測方法的建立

楊玲焰，王立鵬，榮 榮

(1.蘇州西山生物技術(shù)有限公司，蘇州 215123； 2.西交利物浦大學(xué)，蘇州 215123)

由于獼猴屬(Macaques)動物與人類擁有共同祖先，他們的基因相似率大于93%，且在神經(jīng)學(xué)、生理學(xué)、代謝類疾病及對微生物的敏感性方面表現(xiàn)的都非常相似，所以獼猴屬動物尤其是食蟹猴(Macacafascicularis, Cynomolgus monkeys)和恒河猴(Macacamulatta, Rhesus monkeys)作為非人靈長類實驗動物模型，被廣泛用于生物醫(yī)藥研究中，近幾年，生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的投入不斷加大，干細胞和移植研究也得到飛速發(fā)展，而對用于這方面研究的供體和受體動物的血型要準確的掌握，ABO血型是最重要的血型系統(tǒng)，所以當實驗猴被用于研究時就需要明確知道它的ABO血型，才能防止在移植中出現(xiàn)嚴重的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致實驗的失敗及資源的浪費。

目前應(yīng)用于人ABO血型鑒定的常規(guī)技術(shù)仍是基于抗原抗體反應(yīng)的血凝實驗和微柱凝膠實驗，但用于人血型檢測的商業(yè)試劑并不適用于實驗猴的血型鑒定。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，ABO血型相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列都已確定，使血型研究進入分子生物學(xué)時代。事實上血型差異主要是與基因突變有關(guān)，ABO血型基因上存在豐富的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，通過分子生物學(xué)方法檢測ABO血型基因的SNP位點，可以確定A，B或AB表型。目前檢測SNP的方法很多，主要有Taqman PCR、普通PCR結(jié)合Sanger測序的方法、下一代測序 (next generation sequencing, NGS) 技術(shù)等。國際上已有多篇報道，用多重普通PCR方法或?qū)崟r定量PCR進行實驗猴的ABO血型分析[1-6]。競爭性等位基因特異性PCR(competitive allele specific PCR，KASP)是在等位基因特異性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)基礎(chǔ)上，在PCR試劑中加入通用的熒光探針，通過引物3’末端堿基與SNP位點上的堿基特異互補，然后通過直接識別熒光信號來對SNP分型以及檢測序列的插入和缺失，目前該技術(shù)在植物育種方面應(yīng)用較多，本文首次將KASP方法應(yīng)用于實驗猴ABO血型檢測，所選的2個SNP位點，是實驗猴表達A和B轉(zhuǎn)移酶所必需的，第一個SNP位點是檢測A或B表型基因區(qū)域內(nèi)負責編碼第266位氨基酸的突變；第二個SNP位點是檢測第268位氨基酸的突變[5,7]。

目前尚無文獻報道用KASP方法進行實驗猴ABO血型檢測。本文建立的KASP方法相較于普通PCR方法，節(jié)省了大量的時間；相較于Taqman探針法，節(jié)約了合成探針的費用；本文同時還建立了普通PCR結(jié)合Sanger測序法用于血型檢測，適合沒有實時定量PCR儀的實驗室開展ABO血型分析。

1 材料和方法

1.1 樣本

1.1.1 已知樣本

15份已確定ABO血型的食蟹猴核酸樣本由美國VRL實驗室提供，干冰運輸至本公司，-20℃存放。

1.1.2 重復(fù)性驗證樣本

5份食蟹猴外周血樣本(EDTA.K2抗凝)，來自于昆明某實驗猴養(yǎng)殖單位；1份恒河猴外周血，來自四川某實驗猴養(yǎng)殖單位，共計6份樣本冷藏快遞運輸至本公司，4℃存放。

1.1.3 臨床樣本

實驗猴外周血樣本(EDTA.K2抗凝)，分別來自于廣州、廣西、四川、海南4個實驗猴飼養(yǎng)場，共計51份樣本，其中食蟹猴全血38份，恒河猴全血13份，樣本冷藏快遞運輸至本公司，4℃存放。

表1 ABO血型鑒定引物

1.2 主要試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP318)，KASP試劑(LGC， KBS-1016-001)，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) (TaKaRa, R001WZ)，dNTP Mix (2.5 mmol/L) (Takara, 4030)，瓊脂糖(天根生化，RT101)，GelRed(博美達，41003-0.5 mL)，特異引物用Primer 3軟件設(shè)計，由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物測序由蘇州泓迅生物科技股份有限公司完成。熒光定量PCR儀(Bio-Rad，CFX96)，普通PCR儀(杭州博日科技有限公司，TC-96/G/H(b)A)，紫外分光光度計(GE, Nanovue plu)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔，Genosens1560)。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

(一)重復(fù)性驗證樣本

每個樣本取500 μL抗凝全血，做5個重復(fù)，參照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取核酸，用紫外分光光度計測定核酸濃度，稀釋樣本使其核酸濃度調(diào)整為10 ng/μL左右。

(二)臨床樣本

每個樣本取500 μL抗凝全血，參照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取核酸，用紫外分光光度計測定核酸濃度，稀釋樣本使其核酸濃度調(diào)整為10 ng/μL左右。

1.3.2 SNP位點的選取及引物設(shè)計

針對Premasuthan等[5]發(fā)布的位于15號染色體上7號外顯子的編碼區(qū)功能性突變位點的序列，用Primer 3在線引物設(shè)計軟件設(shè)計3組引物組，引物序列見表1。A組和B組引物組，為KASP方法所用的引物，可特異性識別這2個SNP位點上的堿基。C組引物是在這2個SNP位點的外圍設(shè)計的1對引物，用于Sanger測序驗證。

1.3.3 KASP法

A組和B組引物組分別在2個體系中擴增。反應(yīng)體系：2×PCR試劑預(yù)混液5 μL；A組或B組引物混合液(F/H/R引物濃度為12/12/15 μmol/L)0.14 μL。每個體系均設(shè)立A型，B型，AB型陽性對照，以及不加核酸的空白對照。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性15 min，94℃ 20 s，退火溫度61℃開始每個循環(huán)降0.6℃，1 min，10個循環(huán)；94℃ 20 s，退火溫度55℃ 1 min，26個循環(huán)；94℃ 20 s，退火溫度57℃ 1 min，12個循環(huán)； 30℃ 30 s，讀取FAM和HEX熒光信號，采用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件分析結(jié)果。

1.3.4 普通PCR及測序

反應(yīng)體系：10× PCR buffer (Mg2+) 2.5 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 2.0 μL，C組引物等量混合液F/R (10 μmol/L) 1 μL，水14.3 μL，DNA模板5 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL。每個體系均設(shè)立陽性對照，以及不加核酸的空白對照。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 45 s，退火溫度58℃ 30 s， 72℃ 30 s，45個循環(huán)，72℃ 延伸5 min。電泳確認：取5 μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后，成像系統(tǒng)拍照。測序及序列分析：將PCR產(chǎn)物測序后用DNASTAR 7.1軟件分析序列中對應(yīng)SNP位點的堿基序列。

2 結(jié)果

2.1 已知樣本的方法確認

2.1.1 KASP法結(jié)果

用KASP分型方法共檢測15份已知血型樣本，通過qPCR儀對產(chǎn)物中熒光信號的識別，可以很好地區(qū)分ABO血型。圖1 是A引物組的KASP分型結(jié)果，藍色正方形聚集點為HEX熒光信號，識別的是A型第266位氨基酸對應(yīng)的SNP突變位點的T堿基；橙色圓形聚集點為FAM熒光信號，識別的是SNP突變位點的A堿基；綠色三角形聚集點為同時有FAM和HEX熒光信號，同時識別到A和T堿基，這些樣本在該位點是雜合型的；黑色正方形點是空白對照，無熒光信號未識別到T或A堿基。15份已知樣本中KASP分型得到A型、B型和AB型各5份，與美國VRL公司用Taqman PCR方法分型結(jié)果完全一致。

圖1 KASP法鑒定ABO血型分型聚類圖Figure 1 ABO genotyping results by KASP

2.1.2 普通PCR結(jié)合Sanger測序方法驗證結(jié)果

對這15個已知樣本進行PCR擴增，產(chǎn)物測序后片段分析，最終得到A型、B型、AB型各5份，與KASP分型結(jié)果及美國VRL公司用Taqman PCR方法的分型結(jié)果完全一致，在2個SNP位點上的堿基與KASP分型結(jié)果一致。其中A型、B型、AB型3份樣本的測序結(jié)果見圖2，紅框中為對應(yīng)的2個位點的測序結(jié)果，圖最上面的數(shù)值為測序后核酸序列中各堿基的排序號。

2.2 KASP方法的重復(fù)性驗證結(jié)果

KASP方法檢測了2份A型血，3份AB型血，1份B型血，每個樣從核酸提取到KASP檢測做了5次重復(fù)，每個血樣5次重復(fù)提取后的分型結(jié)果完全一致，針對2個SNP位點的KASP體系，血型結(jié)果也是完全符合(見圖3)。

2.3 臨床樣本檢測

2.3.1 KASP法結(jié)果

共檢測實驗猴全血樣本51份，包括食蟹猴樣本38份，恒河猴樣本13份，表2為來自不同猴場血樣的血型結(jié)果，其中A型血9份(17.6%)，B型血19份(37.3%)，AB型血23份(45.1%)，4個實驗猴養(yǎng)殖場均存在A型、B型、AB型動物，但未檢出O型血動物。

2.3.2 普通PCR結(jié)合Sanger測序法結(jié)果

選擇KASP方法鑒定出的A型、B型、AB型臨床樣本各5份，用普通PCR擴增并測序后分析，所得的2個SNP位點上的堿基與KASP分型結(jié)果完全一致。

圖2 A型、B型、AB型樣本普通PCR序列比對圖Figure 2 Type A, B and AB sequence alignment from the PCR products

來源OriginA型Type AB型Type BAB型Type AB四川(恒河猴)Sichuan (Rhesus monkeys)364海南(食蟹猴)Hainan (Cynomolgus monkeys)139廣西(食蟹猴)Guangxi (Cynomolgus monkeys)212廣州(食蟹猴)Guangzhou (Cynomolgus monkeys)398食蟹猴Cynomolgus monkeys61319實驗猴Laboratory monkeys91923

圖3 KASP法鑒定ABO血型重復(fù)性驗證結(jié)果分型聚類圖Figure 3 Repeatability verification of the ABO genotyping results by KASP

3 討論

靈長類動物的ABO血型存在跨物種多態(tài)性[8]。ABO血型系統(tǒng)為三復(fù)等位基因，有IA、IB和i三個基因，IA負責編碼N-乙酰氨基半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶，IB編碼D-型半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶，對抗原前體H進行不同的修飾后，進而得到了A抗原或B抗原，而i基因則不能編碼任何糖基轉(zhuǎn)移酶，故抗原前體H保持不變[9]。ABO血型的決定基因位于15號染色體上的9q34.1-9q34.2，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子，而第6和7外顯子上占了其多數(shù)的編碼序列，這些序列負責編碼ABO糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域，其中外顯子7共編碼344個氨基酸，占總ABO蛋白的催化域65%，血型差異主要是與基因突變有關(guān)，A抗原第266位氨基酸為亮氨酸和第268位為甘氨酸，而B抗原第266位為甲硫氨酸和第268位為丙氨酸[10]。因此可通過第266和268位密碼子堿基的改變來區(qū)分A和B糖基轉(zhuǎn)移酶。

基于抗原抗體反應(yīng)的人ABO血型檢測常規(guī)方法一般都不適用于實驗猴，主要原因有以下三點：一是實驗猴紅細胞表面的類人ABO抗原分子與人類的抗原分子結(jié)構(gòu)不一定完全相同；二是實驗猴的ABO抗原分子抗原性極其微弱，在實驗猴的紅細胞表面ABH抗原未找到；三是人源性的ABO抗血清用于實驗猴檢測，存在種屬抗體的干擾[11]。之前有研究者用反定型和唾液抑制實驗檢測實驗猴血型，也有用流式方法檢測實驗猴體內(nèi)血型抗體水平[12-14]，但是對樣本要求比較高，需要獲取動物的新鮮血液或足夠量的唾液樣本，而且由于方法的局限性，得到結(jié)果的可靠性不高。市面上可獲得的用于人血型檢測的商業(yè)免疫試劑，用于實驗猴血型檢測一般均得不到可靠結(jié)果，且血清學(xué)結(jié)果有時也比較難判定。也有學(xué)者研究制備出實驗猴專用ABO抗血清和改良吸收放散技術(shù)，但該方法耗時長，也會有不確定的結(jié)果出現(xiàn)[11,15]。

隨著分子生物學(xué)方法在人類ABO血型中的應(yīng)用，研究人員通過對實驗猴基因序列進行分析，通過識別SNP位點堿基差異，對實驗猴進行ABO血型分型。AS-PCR方法有快速、經(jīng)濟、準確等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，如疾病SNP監(jiān)測，血型分析等。Muro等[2]用AS-PCR結(jié)合定量PCR方法成功進行人ABO血型的檢測。本文所用的KASP方法是基于AS-PCR原理，在PCR試劑中增加了通用的熒光探針，可通過直接識別熒光信號實現(xiàn)SNP快速分型。

本研究建立了KASP血型鑒定方法并與美國VRL實驗室用的Taqman PCR方法進行了比較，15份已知樣本的分型結(jié)果完全一致。同時新建立的KASP方法也與新建的普通PCR方法進行了比較，結(jié)果完全一致。本文用建立的KASP方法檢測了國內(nèi)4家猴場的血液樣本51份，檢測到A型血占18%；B型血占37%；AB型血占45%；Premasuthan等[4]用多重PCR篩查78頭恒河猴，其中B型血的動物占了51%，其次為AB型占28%，A型21%，與本實驗恒河猴中血型分布相似，B型血占比為46%；Premasuthan等[5]于2012年又發(fā)表一篇文章，通過實時定量PCR方法，增加了89頭食蟹猴的篩選，其A、B、AB型分布為20%，48%，32%，而本實驗食蟹猴中AB型血占比最高為50%，其次為B型34%，A型16%。Kanthaswamy等[6]擴大了樣本量用熒光定量PCR方法篩查了1256只恒河猴，1113只食蟹猴，恒河猴中B型血占比達90%，A型占2%，AB型占8%；食蟹猴中A、B、AB型分別占39%、33%、28%。

本文所建立的ABO基因分型技術(shù)，是首次將KASP方法應(yīng)用于實驗猴ABO血型檢測，是在分子基因水平上的一種快速，可靠，敏感、低成本的檢測方法。本文新建的普通PCR方法結(jié)合Sanger測序同樣可對實驗猴進行ABO血型分型，對于沒有定量PCR儀的實驗室同樣適用。該方法對樣本類型及新鮮程度都要求不高，血液樣品也可用濾紙片承載運輸，可用于實驗猴的ABO血型分型，為器官移植特別是干細胞移植非人靈長類動物模型研究提供有效的保證，目前本實驗人員用該方法進行臨床樣本檢測尚未檢出O型血，這與其他研究者的結(jié)果也相符[4-6]。當然不同血型占比與樣本量和動物的來源都密切相關(guān)，本實驗的數(shù)據(jù)還需進一步擴大樣本量進行統(tǒng)計后給出血型分布的結(jié)論。人類的15號染色體的第6外顯子上存在O型血表型相關(guān)的突變位點，有文獻報道在實驗猴中找到同樣的位點[16]，但有多篇文獻報道，對實驗猴的第6和第7外顯子基因序列測序分析，均未發(fā)現(xiàn)有突變與O型血表型有關(guān)[4,7,17]。當然也有文獻報道通過血清學(xué)方法檢出有實驗猴是O型血[18-19]，但是考慮到血清學(xué)方法的弊端，對此結(jié)果仍然存在爭議；也有學(xué)者提出假設(shè)在編碼區(qū)外有可以識別O型等位基因的存在[5]；近期Choi等[3]報道O型血的存在，作者通過針對第7外顯子區(qū)域設(shè)計引物，用PCR方法篩查了66只恒河猴，有8%的動物為O型血，相關(guān)人員正在對這些與O型血表型相關(guān)的位點進行驗證中。實驗猴是否存在O型血表型目前還是比較爭議的，下一步計劃就是找到這個或多個位點。