成年狨猴腎臟細胞體外培養體系的建立及CRISPR/Cas9基因編輯的應用

叢日旭，佟 巍，向志光，張麗芳，劉先菊，阮研碩，郭 智，劉云波

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021)

基因修飾大小鼠對生物醫學做出了巨大貢獻。由于靈長類動物和嚙齒類動物之間的神經生理功能、代謝途徑和藥物敏感性等遺傳和生理差異，阻礙了從大小鼠疾病模型中的結果直接應用于人類臨床[1]。基因修飾靈長類動物疾病模型在人類神經系統疾病研究中，發揮著更為重要作用[2-3]。普通狨猴(common marmoset，Callithrixjacchus)是一種新世界靈長類動物，與恒河猴相比，雖與人類的親緣關系較遠，但它們具有多胎(每胎2～4只)、妊娠期較短(約144 d)、全年發情等特性[4-5]等，生殖特性，利用這種特性可以種系傳播的轉基因狨猴已經被報道[6-7]，狨猴作為人類疾病的基因修飾靈長類模型有獨特的價值。

由于非靈長類動物基因修飾較大小鼠相比、胚胎難以獲得且數量有限，生殖周期較長，生育數量少，基因組更復雜等因素的限制[8-9]，選擇編輯效率高的基因修飾技術和活性高sgRNA靶點顯著提高基因修飾效率。CRISPR/Cas9系統因其系統成分簡單、操作方便、突變效率高、成本低廉的優點，已成為現在發展最為迅速、國內外學者廣泛研究開發、應用于多種生物體基因組的定向基因編輯技術[10]。普通狨猴在我國是一種較新的實驗動物，其相關細胞系較少。為了獲得可用于sgRNA篩選的細胞，本文建立狨猴腎臟細胞培養體系，及細胞相關轉染，抗性篩選體系，將含有sgRNA與Cas9質粒共同轉入狨猴細胞，檢測sgRNA靶點的活性及基因編輯效率，為基因修飾狨猴模型的構建的基因修飾靶點的篩選提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通狨猴1只，雄性，體重280 g，27月齡，普通環境飼養，由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供，生產許可證號[SCXK(京)2014-0011]，使用許可證號[SYXK(京)2017-0027]，本實驗通過實驗動物倫理委員會審查，符合3R原則，實驗動物倫理委員會批準號：LYB18003。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12培養基(11330032, Gibco)，RPMI1640培養基(11875093, Gibco)，胎牛血清(10099141，Gibco)，0.25%胰酶-EDTA(25200056, Gibco)，青霉素鏈霉素溶液雙抗(SV30010，HyClone)，二甲基亞砜DMSO(D2650，Sigma),嘌呤霉素(P8833，Sigma)，殺稻瘟菌素(15205，Sigma)，胰島素(I5500，Sigma)，轉鐵蛋白(T0665，Sigma)，地塞米松(D4902，Sigma)，ViaFectTM Transfection Reagent (E4982, Promega)。CO2恒溫培養箱(Thermo)，離心機(Multifuge 1S-R, Thermo)，電熱恒溫水浴鍋(SSW-600-2S，上海博源實業有限公司醫療設備廠)，倒置顯微鏡及成像(CF-2098,長方)，PCR儀(T100, Bio-Rad)。

1.3 實驗方法

1.3.1 狨猴腎臟原代細胞培養

培養液Ⅰ：RPMI1640+10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+1%雙抗;

培養液Ⅱ：DMEM/F12+10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+1%雙抗;

兩種培養中分別加入10 μg/mL胰島素，5.5 μg/mL轉鐵蛋白和40 ng/mL地塞米松，促進原代細胞增殖。

無菌操作摘除狨猴腎臟組織。去除腎臟上的脂肪和腎包膜， PBS沖洗并將其剪成1 mm3的碎塊，洗滌3次。

(一)貼壁組織塊法[11]：1 mm3組織小塊擺放在培養瓶底，輕輕將培養瓶翻轉，瓶底朝上，加入培養液Ⅰ 5 mL。置于 37℃培養箱中培養3 h左右，緩慢翻轉培養瓶，使液體緩緩覆蓋組織塊。

(二)消化法[12]，離心管加入約4倍量的0.25%胰酶-EDTA，放置在 37℃ 電熱恒溫水浴鍋中消化，每5 min搖動1次，30 min后，去除組織塊，加入培養液Ⅰ終止消化。細胞懸液以800 r/min低速離心 10 min，棄上清液，加培養液Ⅰ輕輕吹打形成細胞懸液，置于培養瓶內，培養液Ⅰ5 mL。

37℃，5% CO2培養箱中進行培養；48 h后觀察細胞遷出情況，拍照并按1/3～1/2換液量更換培養基。

1.3.2 傳代培養

當細胞生長到細胞瓶底70%～80%左右時對細胞進行傳代培養，顯微鏡下觀察細胞細化程度，以細胞變圓不連接成片為標準，時間2～3 min左右，吸去消化液，加入培養液終止消化并吹打，按照1∶3。

1.3.3 生長曲線的測定與繪制

細胞計數：吸取500 μL 細胞懸液加入臺盼藍(0.4%)，并吹打均勻。然后吸取10 μL沿著邊緣緩緩滴入一次性細胞計數板，保證計數板充滿懸液，不留氣泡。對9個大格中沒有被染液染色(活)的細胞數目進行計數。細胞數量計算如下：

n=N/3×106

式中n表示每毫升細胞懸液中的活細胞數，N表示計數板4個大格子的活細胞數。

1.3.4 細胞凍存與復蘇

冷凍保存：用0.25%胰酶-EDTA消化細胞，培養液終止消化，收集細胞至離心管，800 r/min，10 min，棄上清。用冷凍液(90% FBS + 10% DMSO)，重懸，將冷凍管放入程序降溫盒內，放在-70℃冰箱暫存，置于液氮中長期保存。

解凍復蘇：從-70℃冰箱取出冷凍管，移入37℃水浴鍋內，并搖晃明至完全解凍。時間不超過3 min。取少量進行活細胞計數。800 r/min離心，10 min，傾棄上清，徹底去除保護劑，再往加入培養液，充分混懸后分瓶培養。

1.3.5 藥物抗性篩選與轉染

消化狨猴腎臟細胞至6孔板，第2天更換培養基，將1 mg/mL的連接有GFP的質粒3 μL與ViaFectTMTransfection Reagent和Lipo2000，按照1∶3的進行轉染，24 h后，熒光顯微鏡觀察轉染效率。

消化狨猴腎臟細胞至24孔板，第二天加入藥物，殺稻瘟菌素+嘌呤霉素：(0+0)、(1+0.5)、(2+1)、(4+2)、(8+4)、(10+5) μg/mL，觀察48 ～72 h，每個濃度3個孔，細胞死亡數在90%左右，定為藥物篩選終濃度。

1.3.6 CRISPR-Cas9在狨猴原代腎臟細胞的應用研究

選擇狨猴SIRT1基因的第五個外顯子的兩個靶點:A1 (GAACATAGACACGCTGGAACAGG)和A2(GACACGCTGGAACAGGTTGCAGG)進行質粒構建，將 sgRNA(pGL-U6-gRNA-Puromycin)和 cas9(pST1374-flag-linker-Cas9)質粒各1 μg/mL，同時轉入狨猴F3腎臟細胞， 8 μg/mL的 Blasticidin(殺稻瘟菌素)和 4 μg /mlpuromycin(嘌呤霉素)抗性篩選，2 周后鹽析法提取細胞基因組，擴包含 sgRNA結合位點的片段，測序驗證靶點處是否引入突變。

1.4 數據與圖片

生長曲線數據處理軟件為Graph Pad，圖像處理軟件為Image J。

2 結果

2.1 原代腎臟細胞培養

對腎細胞進行培養，48 h后可明顯看出在貼壁的組織塊及消化的團塊周邊緣遷出較透明的細胞 (圖1a和1b)。更換培養基后再培養5～6 d，可以看到有更多的細胞團從組織塊邊緣脫落。經7 d的培養，大多數組織塊周圍遷出的細胞單層。胰酶消化法由于細胞分散細胞生長速度快，單層細胞占培養瓶面積>70%，組織塊貼壁法培養的細胞由于組織塊脫落細胞遷出慢，單層細胞<50%(圖1c和1 d)。培養基中腎細胞多為圓形或梭形，為致密的單層細胞。實驗表明，RPMI1640培養液可以用于腎臟細胞的原代培養。組織貼壁法與胰酶消化法均可得到原代培養的細胞，相比較之下，胰酶消化法獲得細胞比組織塊貼壁法獲得細胞生長速度快。

注：a：48 h后，組織貼壁法培養的腎臟細胞；b：48 h后，胰酶消化法培養的腎臟細胞；c：7 d后，組織貼壁法培養的腎臟細胞；d：7 d后，胰酶消化法培養的腎臟細胞。圖1 RPMI1640培養液培養狨猴腎臟原代細胞(×40)Note. a， Kidney cells by adhesive culture for 48 h. b， Kidney cells obtained by trypsin digestion, cultured after 48 h. c， Kidney cells by adhesive culture for 7 d. d, Kidney cells obtained by trypsin digestion, cultured after 7 d.Figure 1 The primary culture of marmoset kidney cells in RPMI1640 medium

2.2 腎臟細胞培養傳代

狨猴腎細胞傳代后培養大約3～4 d可長成單層細胞，為梭形，胞膜完整清晰，胞質明亮 (圖2a)。培養液Ⅰ(RPMI 1640)傳代培養至第4代時，細胞排列較疏松，細胞多呈圓形，細胞形態改變，胞膜邊緣較清晰。細胞出現衰老現象，在F1代更換，DMEM/F12培養液Ⅱ后，在第8代會出現類似的衰老現象。實驗表明，在相同培養條件下，狨猴腎細胞在DMEM/F12培養基中生長比RPMI 1640較好。由于本次實驗取材的是成年狨猴腎臟，在本實驗條件下能培養至第7代，細胞增殖能力有限，為保證實驗結果的穩定性和可靠性，選取DMEM/F12培養基中生長2～5代的細胞進行后續實驗。

2.3 生長曲線的測定與繪制

取生長狀態良好的細胞，制備細胞懸液。計數，將細胞懸液接種于24孔培養板中每天取出3瓶孔細胞進行計數，計算均值。培養3 d給未計數的細胞更換培液。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，繪制細胞的生長曲線。狨猴腎臟細胞生長曲線中，在一定在時間內，細胞數量隨時問的增加而增殖，生長狀態良好。其中0～1 d為潛伏期、1～3 d為細胞增殖期、3～5 d為對數生長期、5～7 d為平臺期(見圖3)。

注：a：F1代腎臟細胞；b：F4代腎臟細胞。圖2 RPMI1640培養不同代數狨猴腎臟細胞形態對比Note.a， The kidney cells of F1 generation. b， The kidney cells of F4 generation.Figure 2 Comparison of the morphology of marmoset kidney cells cultured in RPMI1640 medium.

圖3 狨猴腎臟細胞生長曲線(F3)Figure 3 Growth curve of the marmoset kidney cells (F3)

2.4 細胞凍存與復蘇

狨猴腎臟細胞復蘇后，進行細胞的活力檢測(臺盼藍排斥實驗)，復蘇成活率約為 70%～80%。證明狨猴腎臟細胞的生物學性狀穩定，用90% FBS + 10% DMSO可成功凍存。

2.5 藥物抗性篩選與轉染

熒光顯微鏡觀察結果，ViaFect和Lipo2000相比，ViaFect的轉染率大于60%，明顯高于Lipo2000(如圖4)，但隨著細胞轉染率的增高，對細胞的毒性也會增大。細胞抗性篩選適宜濃度嘌呤霉素4 μg/mL，殺稻瘟菌素8 μg/mL。

注：a：ViaFect；b：Lipo2000。圖4 不同轉染試劑GFP質粒轉染后絨猴腎臟細胞(F3)Figure 4 Marmoset kidney cells transfected with GFP plasmid (F3). a. ViaFect. b. Lipo2000.

2.6 CRISPR-Cas9在狨猴細胞的應用研究

細胞DNA提取后，針對sgRNA靶點合成特異性引物F(GGCCAAGTTCGCTAATTGCTG)，R(GCAACGGCAACATCTTTGAA)，對基因組進行擴增(如圖5左)，兩組細胞均在目的擴增600 bp處有明顯條帶，且單一，將PCR產物測序，測序結果表明，SIRT1基因的兩個靶點，均從sgRNA的切割位點開始出現雜峰，證明了sgRNA成功地引入基因組突變(如圖5右)。Cas9可以用于狨猴腎臟細胞編輯。

3 討論

狨猴作為靈長類動物替代模型越來越多應用于生物醫學研究，但狨猴相關細胞培系卻很少。在對狨猴各組織器官培養的實驗基礎上，選取細胞增殖快、細胞數量多的狨猴腎臟細胞作為目的細胞。哺乳動物的腎臟有15～20多種細胞，如腎小球毛細血管內皮細胞、腎小球毛細血管上皮細胞、腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞及腎間質成纖維細胞等[13]。本研究得到的腎臟細胞為多種細胞混合細胞，細胞均一性不好，但除了生殖細胞外每個細胞都有全部的遺傳信息，可以將CRISPR/Cas9基因編輯技術應用培養的狨猴腎臟細胞。此外，腎臟細胞還可以應用于生物制品的生產、轉基因動物的培養、藥物篩選、器官移植培養等方面[14-15]。

注：a：PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳(從左到右Marker，A1,A2)；b:SIRT1基因A1,A2位點與WT的測序結果。圖5 Cas9基因編輯技術在狨猴腎臟細胞的應用Note. a, 1% agarose gel electrophoresis of the PCR products (from left to right: marker, A1, A2). b, Sequencing results of SIRT1 gene A1, A2 and WT loci.Figure 5 Application of Cas9 gene editing in the marmoset kidney cells

本研究進行了狨猴腎臟的原代培養的研究，在相同培養條件下培養7 d觀察組織貼壁法和胰酶消化法培養的細胞形態與生長速度。實驗結果表明，組織塊貼壁法，對細胞的損傷較小，但由于細胞從組織塊遷出速度慢，使得細胞培養周期加長。胰酶消化法可在短時間內獲取大量單個細胞，細胞增殖快，原代細胞培養的周期縮短(圖1)。選擇不同培養基培養狨猴腎臟細胞實驗中，研究人員發現再添加同等劑量促進細胞生長的血胰島素、轉鐵蛋白和地塞米松培養基，DMEM/F12比RPMI 1640更適合培養狨猴腎臟細胞。可能與兩種培養基中丙氨酸、半胱氨酸及鐵、鋅無機鹽及次黃嘌呤鈉、亞油酸、硫辛酸等的含量有關。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染和抗性的篩選已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。本研究將帶有GFP的質粒分別用實驗室常用的兩種轉染試劑ViaFectTMTransfection Reagent和Lipo2000進行轉染。結果表明，ViaFectTMTransfection Reagent轉染效率大于50%，明顯高于Lipo2000(圖4)，為保證細胞的活性，適當降低轉染試劑的使用劑量，可以獲得更好的效果。與此同時，確定嘌呤霉素和殺稻瘟菌素兩種抗生素在抗性篩選時的使用的濃度分別為4 μg/mL、8 μg/mL。

本文以狨猴腎臟細胞培養、轉染和篩選體系為基礎，選取了對代謝綜合征、細胞凋亡和神經退行性疾病等發揮重要作用的SIRT1基因[15]的兩個位點，與Cas9一起轉染到狨猴腎臟細胞中，測序結果表明Cas9可以用于狨猴腎臟細胞編輯，狨猴腎臟細胞可以用于基因修飾靈長類動物模型建立的基因靶點切割活性的篩選，同時也為狨猴腎臟細胞系的建立及永生化提供基礎。。