金釵石斛總生物堿對糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠胰島素抵抗的影響

黃 琦，廖 鑫，吳 芹，王 攀，石京山*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563000； 3.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室，貴州 遵義 563000)

糖尿病是常見的代謝性疾病之一，往往與其他代謝性疾病并存，例如肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血癥等。胰島素抵抗和或胰島素分泌不足是糖尿病的主要病理生理特征，而胰島素抵抗、肥胖、血脂紊亂及脂肪肝構(gòu)成代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)。化學(xué)藥物中對代謝綜合征進(jìn)行干預(yù)的藥物較少，而傳統(tǒng)中藥對于改善血糖的優(yōu)勢雖不如化學(xué)藥物那樣直接和效果顯著，但其對代謝綜合征多種組成疾病的干預(yù)有其優(yōu)勢。本課題組前期初步研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛總生物堿(DendrobiumnobileLindl. alkaloids，DNLA)對實驗性糖尿病動物模型有保護(hù)作用[1,2]。DNLA可降低 db/db小鼠血糖，其機制與改善胰島素抵抗有關(guān)[3]。本題擬進(jìn)一步探討DNLA對以糖尿病、非酒精性脂肪肝(NAFLD)為主要組份的代謝綜合征的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供[SCXK-軍2014-005]。實驗在遵義醫(yī)學(xué)院教育部基礎(chǔ)藥理重點實驗室進(jìn)行[SYXK (黔) 2014-003]。倫理審查編號：倫審[2017] 2-016號。本實驗操作遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

金釵石斛產(chǎn)于貴州省赤水市石斛種植基地，DNLA由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室提取，總堿含量> 98%；鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)購自美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)；大鼠超敏胰島素放免試劑盒，購自美國LINCO公司。蘇木精、伊紅，為北京賽馳生物科技有限公司產(chǎn)品，多聚賴氨酸、胰島素抗體及相關(guān)免疫組化試劑，購自中國武漢博士德生物工程有限公司。奧林巴斯AU2700型自動生化分析儀(日本Olympus公司)，放免計數(shù)儀Gcr-2010(GAMBYT-CR型，中國科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)，尼康光學(xué)顯微鏡(Nikon儀器有限公司)，低溫離心機(centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司)，強生穩(wěn)步倍加型血糖儀及血糖試紙(強生醫(yī)療器材有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的制備

SD大鼠62只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后給予高脂高糖飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，在禁食8 h后給予STZ (40 mg/kg)腹腔注射一次，3 d后每日剪尾取血測定空腹血糖，篩選出空腹血糖連續(xù)3 d ≥ 11.1 mmol/L者為實驗用模型大鼠[4-5]，成模大鼠共60只，2只大鼠于造模后第3天因血糖過高死亡。

1.3.2 實驗分組及給藥

選取雄性SD大鼠10只設(shè)為空白組。模型大鼠按血糖、體質(zhì)量隨機分組為：模型組、DNLA 低劑量組、DNLA 中劑量組、DNLA 高劑量組、二甲雙胍組，每組10只。各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)4周，模型組及空白組給予等體積的雙蒸水灌胃，給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。

1.3.3 標(biāo)本采集及檢測

各組大鼠連續(xù)灌胃4周，禁食8 h麻醉生效后行腹主動脈取血，應(yīng)用低溫離心機分離血清待測。空腹血糖(FPG)應(yīng)用全自動生化分析儀檢測，空腹胰島素(FINS)使用大鼠超敏胰島素試劑盒，采用放射免疫法進(jìn)行檢測。根據(jù)測得的FPG及FINS結(jié)果，按公式計算出各組大鼠的胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR (HOMA-IR=FPG × FINS/22.5)[6]。麻醉取血后處死大鼠，取出肝臟及胰腺組織，用4%中性甲醛固定48 h，進(jìn)行石蠟包埋后制備組織切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，常規(guī)脫水、封片后顯微鏡下觀察組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)。同時采用免疫組化法檢測胰島中胰島素的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠FPG、FINS、HOMA-IR的影響

模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR明顯高于空白組(P< 0.05)；與模型組比較，DNLA中劑量、DNLA高劑量組及二甲雙胍組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR明顯下降(P< 0.05)，見表1。

表1 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠FPG、FINS、HOMA-IR的影響

注：：，與空白組比較，*P<0.05。與模型組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the blank group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

2.2 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

空白組大鼠肝內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡狀脂肪變性，肝細(xì)胞核被脂滴推向一側(cè)，形態(tài)酷似脂肪細(xì)胞。二甲雙胍組大鼠肝臟脂肪變性程度明顯較模型組減輕。DNLA 40、80 mg/kg不同程度的減輕糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟脂肪變性，見圖1。

注：A：空白組；B：模型組； C：二甲雙胍組； D：DNLA低劑量組； E：DNLA中劑量組； F：DNLA高劑量組。圖1 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響(HE染色)Note. A, blank group. B, model group. C, metformin group. D, DNLA low-dose group. E, DNLA medium-dose group. F, DNLA high-dose group.Figure 1 Effects of DNLA on liver histology in the diabetic rats with NAFLD. HE staining.

2.3 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠胰島組織形態(tài)及胰島素表達(dá)的影響

大鼠胰腺組織病理切片進(jìn)行HE染色后顯微鏡下觀察，空白組大鼠胰島呈橢圓形，邊界清晰，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)均較多；模型組大鼠胰島萎縮，形狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少，出現(xiàn)部分空泡化結(jié)構(gòu)；二甲雙胍組與空白組大鼠相比較，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少；DNLA中、高劑量組與模型組比較，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)較多，見圖2(左列)。免疫組化染色后鏡下觀察到模型大鼠胰島數(shù)目較空白組減少，與HE染色結(jié)果相一致，同時可見胰島中胰島素表達(dá)明顯減少；與模型組比較， DNLA中、高劑量組胰島內(nèi)胰島素表達(dá)有不同程度增加，見圖2(右列)。

注：A：空白組；B：模型組； C：二甲雙胍組； D：DNLA低劑量組； E：DNLA中劑量組； F：DNLA高劑量組； 左列：HE, ×400；右列：免疫組化 IHC, ×400。圖2 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)及胰島內(nèi)胰島素表達(dá)的影響Note. A, blank group. B, model group. C, metformin group. D, DNLA low dose group. E, DNLA medium dose group. F, DNLA high dose group. Left column: HE staining. Right column: immunohistochemical Staining.Figure 2 Effects of DNLA on pancreatic histology and INS expression in the diabetic rats with NAFLD

3 討論

代謝綜合征是機體發(fā)生的一種以蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)代謝紊亂的病理生理狀態(tài)，是一組十分復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，其組份包括高血糖、血脂紊亂、超重或肥胖、高血壓等，其基本特征是胰島素抵抗。本研究探討了DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠模型的胰島素抵抗的影響，該模型同時具有高血糖、血脂代謝紊亂、非酒精性脂肪肝，這與文獻(xiàn)報道相符合[7-10]，動物模型成熟且能反應(yīng)代謝綜合征的特點。

目前化學(xué)藥物對代謝綜合征的治療主要是針對各自的疾病進(jìn)行不同的用藥，僅有少數(shù)藥物可同時發(fā)揮多重作用，例如二甲雙胍在降血糖的同時可改善血脂代謝紊亂及脂肪肝[11-12]，這在本研究中也同樣觀察到這一結(jié)果。

中藥的多靶點作用在改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島β細(xì)胞、調(diào)節(jié)血脂、減輕脂肪肝方面具有潛在優(yōu)勢。石斛屬DendrobiumSw. 是蘭科重要的屬之一。石斛作為中藥材，已被廣泛使用達(dá)千年。近幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者從石斛屬植物的藥用部位中分離鑒定出多種化合物，包括生物堿、多糖、黃酮等類化合物。石斛在緩解糖尿病及其并發(fā)癥、抑制腫瘤、抗氧化、抗炎等方面的有一定藥理作用[13-14]。多項研究證實石斛有明確的降血糖作用，且對胰島功能有保護(hù)作用[15-16]，而石斛的特征性成分是生物堿。

本課題組采用不同糖尿病動物模型研究了貴州赤水產(chǎn)金釵石斛生物堿對糖脂代謝的影響，不僅局限于其降糖作用的研究，更強調(diào)對整體模型動物代謝紊亂的干預(yù)，前期已發(fā)現(xiàn)DNLA能降低糖尿病模型鼠血糖、血脂，本研究進(jìn)一步證實了其降糖作用，同時觀察到DNLA改善了糖尿病合并NAFLD大鼠的胰島素抵抗，減輕代謝綜合征在肝臟及胰島的病理進(jìn)展，保護(hù)胰島 β 細(xì)胞功能，改善模型大鼠的代謝紊亂綜合征。DNLA改善胰島素抵抗的機制，本課題組前期應(yīng)用db/db小鼠研究已發(fā)現(xiàn)可能與上調(diào)端粒酶活性、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、TERC mRNA表達(dá)，增加POT1、TFR2蛋白表達(dá)水平、下調(diào)TRF1蛋白表達(dá)有關(guān)[3]。

綜上所述，DNLA可改善糖尿病合并NAFLD大鼠高血糖、肝臟脂肪變性，其機制與其改善胰島素抵抗有關(guān)，詳細(xì)的其他分子機制有待進(jìn)一步研究。