截肢手術創傷對大鼠心臟電生理、心功能及eNOS通路的影響

趙桂香，劉志強，古麗扎爾·吐爾遜

(1.新疆醫科大學第六附屬醫院心血管內科，烏魯木齊 830002； 2.新疆醫科大學第一附屬醫院心內管內科，烏魯木齊 830054； 3.新疆喀什疏勒縣解放軍第947醫院特診科，新疆 喀什 844200)

截肢創傷屬于特殊類型的創傷，手術前、后機體會發生應激反應,且延續至術后，損傷害患者身體健康，其中心血管系統是截肢創傷應激作用的重要靶器官[1]。創傷后機體發生炎癥反應、氧化應激、Ca離子超載，導致冠狀動脈供血不足、心律失常、心功能受損等[2]。調查顯示[3]，30%術后并發癥、50%術后死亡原因均為圍術期心血管事件，因此探究截肢創傷心功能變化情況對于臨床治療、預防圍術期心血管事件，提高患者預后具有積極的意義。eNOS/NO通路在維持血管舒張、白細胞黏附以及抑制血小板凝集中發揮重要作用，多項研究指出該通路激活后對心肌缺血再灌注損傷中具有保護作用[4-5]，然而eNOS/NO通路與截肢創傷后心功能的關系，目前尚不清楚，本研究通過復制左后肢截肢創傷模型，觀察大鼠心臟電生理、心功能變化情況，并初步探究作用機制，以期為截肢創傷后心血管系統機制研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

72只健康清潔級雄性Wistar大鼠，8周齡，體質量220～260 g，購于新疆醫科大學基礎研究室，[SCXK2015-0001][SYXK(新)2016-0008]。嚴格遵循動物倫理，倫理審批號：IACUC20170005，統一在溫度25℃，濕度50%～60%，自然光照條件下喂養，期間大鼠自由飲水攝食，飼養1周后用于研究。

1.2 主要試劑與儀器

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒(上海撫生實業有限公司，貨號：A002097)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A003-1、A001-3)；一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒(北京Solarbio公司；貨號：BC1475)；腫瘤壞死因子-ɑ (tumor necrosis factor-ɑ, TNF-ɑ)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、蘇木精—伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE) 染色試劑盒(碧云天生物技術研究所，貨號：P5318、PI326、C0105)；Tunel染色試劑盒(Roche公司，瑞士，貨號：11684817910)；RIPA組織裂解液(碧云天生物技術研究所，貨號：P0013C)；B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白 (Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗(R&D公司，美國，貨號：AF810，AF820)；eNOS、β-actin一抗(CST，美國，貨號：9572、4967)；MP-150型生理信號采集系統(Biopac，美國)；VEVO3100小動物超聲檢測儀(VisualSonics，加拿大)；ChemiDox XRS型凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；XSP-BM21AY熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備[6]

采用3%異戊巴比妥鈉以80 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，采取仰臥位，切開左側腹股溝皮膚，游離股動靜脈，于腹壁牽動靜脈結扎，在膝關節上方1.3 cm處將股靜脈與股動脈之外其它結構完全切除，最終將股靜脈與股動脈剪斷，復制左后肢創傷模型。

1.3.2 動物分組

將大鼠分為正常組(僅麻醉不進行截肢處理)，截肢對照組、截肢0.25 h、截肢0.5 h、截肢0.75 h、截肢1.5 h，每組12只大鼠。

1.3.3 大鼠心電圖(electrocardiogram，ECG)檢測

用3%異戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉大鼠后，利用生理信號采集系統行ECG檢測,于皮下插入針型電極，記錄標準II導聯心電圖，頻率設定為10 kHz，掃描速率設定為200 ms，觀察心率、QT間期、PR間期變化情況。

1.3.4 超聲檢測左心室功能

3%異戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，利用彩色多普勒超聲檢測儀，獲取左心室長軸切面二維圖像，對大鼠左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS),連續檢測至少3個完整心動周期，求得平均值。

1.3.5 大鼠血流動力學檢測

大鼠麻醉后，迅速將右頸總動脈分離，于遠心端用絲線結扎，右側頸動脈插管用40 U/mL肝素生理鹽水浸潤導管，觀察壓力曲線，待曲線呈正弦波形穩定10 min后檢測左心室收縮壓(Leftventeicular Left venteicular systolic pressuere，LVSP)，左心室內壓降低最高速率(+dp/dt max)以及左心室內壓降低最高速率(-dp/dtmax)。

1.3.6 樣本采集

采集各組大鼠尾靜脈血，3000 r/min離心10 min，收集上清液-20℃保存備用。采集尾靜脈血后，麻醉處死，迅速獲取左心室心肌，將外膜脂肪除去后，一部分置于-80℃保存；一部分置于4%多聚甲醛中固定。

1.3.7 指標檢測

嚴格按照試劑盒說明，檢測血清和心肌組織中MPO、MDA、SOD、NO、TNF-ɑ、IL-6水平。MPO活性：1 g心肌組織濕片在37℃環境中被分解1 μmol過氧化氫為1 U/g。MDA采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法。SOD水平采用鄰苯三酚比色法；NO水采用Green法[7]；TNF-ɑ和IL-6采用酶聯免疫吸附法。

1.3.8 HE染色觀察心肌組織形態學變化

常規制備石蠟切片，常規脫蠟脫水后，進行蘇木精染色，10 min后水洗后，0.5%鹽酸乙醇中分化后水洗，氨水中顯藍30 s后水洗，伊紅染液復染2 min，水洗后梯度乙醇水合、二甲苯透明、中性樹脂封片后，置于顯微鏡下觀察心肌組織變化情況。

1.3.9 末端標記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法檢測心肌組織細胞凋亡

常規制備石蠟切片，根據TUNEL試劑盒說明進行操作，檢測心肌組織細胞凋亡情況。凋亡細胞在熒光顯微鏡下發綠色熒光，觀察并保存圖片，采用Image-J軟件定量分析細胞凋亡指數，凋亡指數(apoptotic index，AI)=細胞凋亡數量/細胞總數×100%。

1.3.10 蛋白免疫印跡法檢測心肌組織eNOS、Bcl-2、Bax蛋白表達

取出凍存心肌組織，采用RIPA組織裂解液提取蛋白，離心后，采用BCA法檢測蛋白含量，采用SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，將蛋白凝膠移至PVDF膜上行轉膜反應，脫脂牛奶封閉后添加eNOS、Bcl-2、Bax、β-actin一抗抗體(稀釋倍數為1∶500)，4℃過夜孵育，添加HRP標記二抗(稀釋倍數為1∶5000)，室溫下孵育2 h，采用ECL發光液進行曝光顯影，于凝膠成像儀中觀察條帶，將β-actin為內參蛋白，用Image Pro-Plus軟件定量分析相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 截肢手術后大鼠ECG變化情況

與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.25 h大鼠心率、QT間期、PR間期無顯著變化，差異無顯著性(P>0.05)；截肢后0.5 h，截肢后0.75 h心率逐漸升高、QT間期、PR間期逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h心率降低，QT間期、PR間期升高，差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2 截肢后大鼠心功能及血流動力學指標變化情況

與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.25 h大鼠LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS 無顯著變化，差異無顯著性(P>0.05)；截肢后0.5 h，截肢后0.75 h LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS升高，差異顯著(P<0.05)。見表2。

2.3 截肢后大鼠血清中氧化應激、炎癥水平變化情況

與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.75 h大鼠血清MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6無顯著變化(P>0.05)；截肢后1.5 h MPO、MDA、TNF-ɑ、IL-6升高，SOD降低，差異顯著(P<0.05)。結果如圖1所示。

2.4 截肢后大鼠心肌組織中氧化應激、炎癥水平變化情況

與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.25 h大鼠MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6無顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6升高(P<0.05)，SOD降低(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h MPO、MDA、、TNF-ɑ、IL-6降低(P<0.05)，SOD升高(P<0.05)。結果如圖2所示。

2.5 各組大鼠心肌組織形態學變化

正常組心肌組織染色均勻,細胞形態規則、排列整齊,未出現明顯病理性改變；截肢后0～0.75 h，細胞排列疏松，伴有大量炎性細胞浸潤，細胞呈破碎、壞死狀，隨著時間的延長，心肌組織病理損傷程度加重。截肢后1.5 h后心肌病理損傷程度有所減輕。結果如圖3所示。

2.6 各組大鼠心肌組織凋亡情況

與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.25 h心肌細胞凋亡指數無顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h心肌細胞凋亡指數逐漸升高，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h心肌細胞凋亡指數降低，差異顯著(P<0.05)。結果如圖4和圖5所示。

表1 各組大鼠EGG檢測結果比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與截肢0.75 h組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the normal group.*P< 0.05. Compared with the amputation 0.75 h group,#P< 0.05.

表2 各組大鼠心功能及血流動力學檢測結果比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與截肢0.75 h組比較，#P<0.05。

Note：Compared with the normal group.*P< 0.05. Compared with the amputation 0.75 h group,#P< 0.05.

注： A、B、C、D、E、F分別表示正常組、對照組、0.25 h組、0.5 h組、0.75 h組、1.5 h組。與正常組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠serum鼠MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6水平比較Note. A, B, C, D, E, and F represent the normal group, the control group, the 0.25 h group, the 0.5 h group, the 0.75 h group, and the 1.5 h group, respectively. Compared with the normal group, *P < 0.05.Figure 1 Comparison of the MPO, MDA, SOD, TNF- and IL-6 levels in the rat myocardium in each group

注：A、B、C、D、E、F分別表示正常組、對照組、0.25 h組、0.5 h組、0.75 h組、1.5 h組。與正常組比較，*P<0.05；與0.75 h組比較，#P<0.05。圖2 各組大鼠心肌組織中MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6水平比較Note. A, B, C, D, E, and F represent the normal group, the control group, the 0.25 h group, the 0.5 h group, the 0.75 h group, and the 1.5 h group, respectively.Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the 0.75 h group. #P< 0.05.Figure 2 Comparison of MPO, MDA, SOD, TNF-ɑ and IL-6 levels in myocardium of the rats in each group

圖3 各組大鼠心肌組織的病理學變化。HE染色。Figure 3 Histological changes of myocardial tissues in the rats. HE staining

圖4 各組大鼠心肌細胞的凋亡狀況，TUNEL染色Figure 4 Apoptosis in cardiomyoaytes cells in the rats of each group. TUNEL staining.

注：與正常組比較，*P<0.05；與0.75 h組比較，#P<0.05。圖5 各組大鼠心肌細胞凋亡指數的比較Note. Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the 0.75 h group, #P< 0.05.Figure 5 Comparison of the apoptotic indexes of cardiomyocytes in the rats of different groups

2.7 心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達情況

與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.25 h組織中Bcl-2、Bax蛋白表達無顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h組織中Bcl-2蛋白表達逐漸降低、Bax蛋白表達逐漸升高，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，差異顯著(P<0.05)。結果如圖6和圖7所示。

注：A、B、C、D、E、F分別表示正常組、對照組、0.25 h組、0.5 h組、0.75 h組、1.5 h組。圖6 Western blot檢測心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達Note. A, B, C, D, E, and F represent the normal group, the control group, the 0.25 h group, the 0.5 h group, the 0.75 h group, and the 1.5 h group, respectively.Figure 6 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in the rat myocardial tissues. Western blot.

2.8 各組心肌組織中eNOS/NO水平變化情況

與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.25 h心肌組織中eNOS 蛋白表達無顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h組織中eNOS 蛋白表達逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢1.5 h eNOS 蛋白表達升高，差異顯著(P<0.05)；與正常組相比，截肢對照組、截肢時及截肢后0.25 h組織中NO水平無顯著變化(P>0.05)；截肢后0.5 h、0.75 h組織中NO水平逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。與截肢后0.75 h相比，截肢后1.5 h NO水平升高，差異顯著(P<0.05)。結果如圖 8所示。

3 討論

截肢手術造成的創傷不但會損傷手術部位肢體，而且對機體重要器官如心、肝、肺等均會有一定程度的損傷?；A研究發現截肢創傷大鼠心肌組織染色后組織伴有炎細胞浸潤，電鏡提示心肌線粒體結構腫脹，且峭斷裂，表明截肢創傷也會造成心臟損害，這可能是創傷后患者發生心律失常以及心功能障礙、心源性猝死的重要原因[8]。報道顯示心律失常在圍手術期并發癥中發生率為10%～60%[9]。目前截肢術后心功能損害的發生機制以及治療方法尚不明確。因此本研究通過探究截肢手術后大鼠電生理、心臟功能損傷情況，并初步闡明截肢創傷后心肌損傷的作用機理。

注：與正常組比較，*P<0.05；與截肢0.75 h組比較，#P<0.05。圖7 各組心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達比較Note.Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the amputation 0.75 h group, #P< 0.05.Figure 7 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax proteins in the rat myocardial tissues of each group

肢體創傷后可使局部組織通透性升高、血管內皮損傷引發機體應激反應與炎癥反應，且效應可達心臟，引發心律失常、心肌缺血、心臟功能受損等疾病[10]。本研究發現與正常大鼠相比，截肢手術后0～0.75 h內大鼠心率加快，PR間期、QT間期縮短，提示大鼠截肢創傷后心電圖表現異常。LVSP為評估心肌收縮射血能力的主要指標，+dp/dmax、-dp/dmax為評估心肌收縮、舒張功能的主要指標，LVFS、LVEF均是評估左心室收縮能力的指標，以往研究顯示LVSP、LVFS、LVEF三者水平的下降均表明左心室收縮能力的降低[11]。本研究發現截肢后大鼠LVSP、+dp/dmax、-dp/dmax、LVEF、LVFS水平均降低，且術后0.75 h降至最低，1.5 h水平升高，提示截肢手術會影響大鼠左心室功能，造成左心室舒張、收縮功能降低。本研究進一步通過病理學觀察發現截肢后0～0.75 h，心肌細胞排列疏松，伴有大量炎性細胞浸潤，細胞呈破碎、壞死狀，隨著時間的延長，心肌組織病理損傷程度加重，1.5 h后心肌病理損傷程度有所減輕，提示截肢后心肌組織出現病理性損傷，進而造成心室功能損傷。

注：與正常組比較，*P<0.05；與0.75 h組比較，#P<0.05。圖8 各組心肌組織中eNOS和NO水平比較Note. Compared with the normal group, *P < 0.05. Compared with the 0.75 h group, #P< 0.05.Figure 8 Comparison of eNOS and NO levels in the rat myocardial tissues of each group

正常生理狀態下，體內自由基的合成與清除均處于動態平衡中，當受到病理性損傷后，機體中超氧負離子、羥自由基釋放過多，造成膜磷脂、蛋白等氧化反應加劇，生成大量脂質過氧化物，損傷細胞膜完整性，導致細胞代謝功能受到障礙。MDA為機體中脂質過氧化物代謝產物，因此其水平的高低能夠反應組織自由基水平或細胞損傷程度?；A研究顯示近期較多研究證實脂質過氧化及自由基生成過多是心肌組織損傷的重要原因，心肌組織受損后，組織中自由基過多無法及時清除,影響心肌細胞的呼吸作用，最后導致細胞死亡[12-13]。本研究發現創傷后0～0.75 h心肌組織中MDA升高，SOD降低，在第0.75 h均達到最高值，1.5 h后MDA降低，SOD水平升高，而通過分析本研究大鼠血清中氧化應激、炎癥水平變化情況結果顯示，截肢對照組、截肢時及截肢后0.75 h大鼠血清MPO、MDA、SOD、TNF-ɑ、IL-6無顯著變化；截肢1.5 h MPO、MDA、TNF-ɑ、IL-6升高，SOD降低，此結果與心肌組織氧化應激損傷結果有一定的差異，血清中各檢測指標在1.5 h開始顯著變化，而心肌組織在0.75 h開始顯著變化。與心肌組織相比，血清中各檢測指標變化時間延遲，由此可以說明心肌組織氧化應激損傷不是由于截肢部位釋放的，提示截肢創傷后會造成心肌組織氧化應激損傷，可能是造成截肢創傷后心肌損傷的重要病理學原因。同時也就一步說明創傷后器官損傷會造成炎癥反應失控，血管內皮釋放較多黏附因子，促進中性粒細胞聚集、黏附，進一步釋放大量TNF-ɑ、IL-6等炎性因子，損害組織器官[14-15]。本研究發現截肢創傷后心肌組織中0～0.75 h Bcl-2蛋白表達逐漸降低，Bax蛋白表達逐漸升高，隨后在1.5 h Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，提示截肢創傷后心肌組織中炎癥因子水平升高，造成炎性損傷，與HE染色結果相符合，提示心肌炎性損傷可能為截肢創傷后心肌手段的重要原因。

心肌組織損傷后可引發心肌細胞凋亡進而加重病理損傷，本研究采用TUNEL染色顯示，與正常組相比截肢0.75 h內心肌細胞凋亡指數逐漸升高，1.5 h后心肌細胞凋亡指數降低，提示截肢后可引發心肌細胞凋亡，這可能為導致心肌損傷的重要原因。細胞凋亡過程涉及凋亡誘導蛋白Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2，細胞正常狀況下，Bcl-2、Bcl-XL、Bax以二聚體形式存在于線粒體內以阻礙細胞凋亡；細胞損傷后，Bax蛋白大量表達聚集于線粒體膜上，導致膜通透性增加，促使凋亡因子進入細胞內，激活caspase通路引發細胞凋亡[16-17]。本研究發現截肢創傷后心肌組織中0～0.75 h MPO、TNF-ɑ、IL-6水平逐漸升高，在第0.75 h均達到最高值，隨后在1.5 h水平降低，提示截肢創傷后心肌組織中炎癥因子水平升高，造成炎性損傷，與HE染色結果相符合，提示心肌炎性損傷可能為截肢創傷后心肌手段的重要原因。

NO是由eNOS催化精氨酸生成，在血管擴張中發生重要作用,在心肌損傷時時其水平的升高可抑制心室重構。以往研究顯示內源性NO水平的降低導致血管舒張功能減弱，加重心肌損傷,而內源性NO水平與eNOS的活性密切有關,eNOS活性減弱則會導致NO釋放減少，促進心力衰竭[18]。在動物中研究發現對激活eNOS/NO信號傳導，可降低心肌梗死面積減輕心臟重構不良，因此激活eNOS/NO信號可抑制心肌梗死所致心臟重構[19]。本研究發現截肢創傷后0.75 h內NO水平、eNOS蛋白表達降低，截肢1.5 h NO水平、eNOS蛋白表達升高，提示eNOS/NO信號通路受抑與截肢后心肌損傷有關。

綜上所述，截肢手術創傷后影響大鼠電生理、心功能，使大鼠發生缺血性心電圖改變，心功能受損，引發心肌組織過度氧化應激、炎癥損傷，其機制可能與eNOS/NO通路受到抑制有關，截肢手術創傷后心肌組織損傷機制較復雜，涉及較多信號通路，本研究僅對eNOS/NO通路變化情況進行研究，有關確切機制還有待后續深入探究。