氧化苦參堿聯合全反式維甲酸干預大鼠肝癌變進程中細胞因子的變化

李錦源，黃文濤，韋園園，吳 瓊

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院， 南寧 530022)

肝癌是是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1-2]。在中國，肝癌的發病率僅次于肺癌和胃癌，居惡性腫瘤的第三位[3-4]。由于肝癌發病率高，治療難度大，死亡率高，預后差，故對其防治工作尤為重要。

苦參素(oxymatrine, OMT)是中藥苦參中提取的一種生物堿活性成分，具有消炎、阻止肝纖維化和肝硬化、抗心律失常、抗腫瘤等作用[5]。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是一種維A酸類衍生產物，可調節細胞增殖、分化、凋亡等，還具有很強的抗腫瘤作用。本研究用二乙基亞硝胺(N-nitroso-diethylamin，DEN)為誘變劑建立大鼠肝癌模型[6]，同時用全反式維甲酸聯苦參素對其進行干預，觀察在誘癌及干預過程中大鼠的體征及組織病理學的動態變化，為闡明肝癌的發展及有效預防、治療提供重要參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性6周齡SD大鼠、150只，體重120±25 g，購自購自廣西醫科大學實驗動物中心[SCXK(桂)2015-0013]，飼養于本院動物房 [SYXK(桂)2015-0011]。其中正常組30只，誘癌組60只，干預組60只，飼養溫度：22℃±4℃，相對濕度：50%±5%，實驗過程符合動物3R原則(倫理審批號：2018-2-1-7)。

1.2 主要試劑與儀器

DEN(sigma公司，批號049K1613 V)；苦參素注射液(山東方明藥業集團股份有限公司，批號180104)；全反式維甲酸(Sigma-Aldrich公司，批號R2625)；SYBR Green PCR Master Mix(日本Toyobo公司，批號QPK-346C);總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司，批號15695-020); 辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗 (中杉金橋公司)； p-STAT3、STAT3兔單克隆抗體(Genetex公司，批號2467、3571)；HRP標記的內參β-actin抗體(上海康成生物公司)；IL-6 ELISA試劑盒(上海通蔚，批號20170914)；各基因引物由重慶威斯騰生物公司合成。

ELX800型全自動酶標儀(美國Biotek公司)；PEPS301型電泳儀(美國GE公司)；AU500型全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)；XDS-2型倒置顯微鏡(南京米厘特)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠肝癌模型建立與給藥方法

模型組：DEN劑量為每周第一天灌胃 (10 mg/kg，2.5 mg/mL DEN溶液)，其余6日飲用80 ppm的DEN水溶液，至18周后正常飼養；干預組(ATRA+OMT)：DENA劑量與模型組相同，將ATRA(2 mg/kg)和OMT(200 mg/kg)混勻后，每2 d灌胃一次，持續18周。正常組不做任何處理，作為空白對照。

1.3.2 取材

自建模之日起，實驗第6、12、18周各組隨機抽取8只大鼠，腹腔麻醉后腹主動脈取血，采用自動生化分析儀檢測堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉氨酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、血清谷丙轉氨酶(ALT)水平。動物處死后，取肝組織，置于液氮中保存；對所取肝形態，顏色，表面癌結節數進行觀察和記錄。

1.3.3 病理學觀察

將取出的肝組織經4%多聚甲醛溶液固定，包埋，連續切片，厚度約3 μm，行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學改變。

1.3.4 血清中IL-6含量檢測

采用ELISA法檢測血清中IL-6含量，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 RT- qPCR檢測肝組織let-7a、NF-κB-p65、IL-6和STAT3 mRNA表達

分別取各組大鼠肝組織30 mg，Trizol試劑提取總RNA，根據Revertaid First Strand CDNA Synthesis Kit說明書進行反轉錄反應，合成cDNA，保存在-80℃。GAPDH作為內參，采用重慶威斯騰生物公司合成的let-7a、NF-κB-p6、IL-6及STAT3的引物序列，參照SYBR Green熒光PCR試劑盒說明書，配置反應體系，依次進行逆轉錄及擴增反應。獨立實驗重復3次。最后由計算機自動計算并讀出各組Ct值，系統軟件進行結果分析：采用2-ΔΔCt表示目的mRNA的含量。

1.3.6 Western blot檢測

大鼠處死后，迅速取肝組織，采用RIPA裂解法提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度并調至一致。進行SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉膜，然后脫脂奶粉封閉2 h，加適量一抗STAT3、p-STAT3在4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，經ECL顯色后膠片曝光顯影，并用Image J軟件對條帶進行分析，以A目的蛋白/AGAPDH的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 OMT聯合ATRA對大鼠肝表面肝癌結節形成的影響

正常組大鼠肝顏色淡紅，質地柔軟，光滑，無結節。在DEN誘導下，建模大鼠會依次經歷肝炎，肝硬化進而形成肝癌。研究人員發現在第6周時，各組大鼠肝沒有結節出現，到第12周時出現少量結節，而第18周時出現大量結節。與模型組比較，干預組肝表面結節數明顯減少，見圖1。

2.2 HE染色觀察各組大鼠肝病理改變

第18周時，正常組肝細胞無變性、壞死，肝小葉結構正常，無炎癥及纖維化；模型組發生明顯肝細胞異型性增生，多數增生肝細胞核仁普遍增大，出現核異質變以及癌變細胞，且周圍組織肝細胞異型性明顯，伴癌細胞浸潤，同時出現腺管樣及柱狀癌巢結構，周圍的肝組織內可見微小癌衛星灶。癌周組織肝細胞增生灶、脂肪變性、嗜酸性變、細胞水腫，以及增生及非典型增生結節，呈典型的肝硬化表現；干預組肝組織中發現有癌結節，但肝細胞變性壞死較模型組程度輕、腫瘤病灶數減少。見圖2。

圖1 第18周時各組大鼠肝情況觀察Figure 1 Gross appearance of the rat livers at the 18th week

注： 與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖2 各組大鼠肝病理改變(n=8)Note. Compared with the normal group， aP<0.05. Compared with the model group， bP<0.05.Figure 2 Pathological changes of the rat livers in each group

2.3 ELISA法檢測血清IL-6含量

建模后第6，12，18周時與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6水平明顯上升(P<0.05)；在第12、18周時與正常組比較，干預組大鼠血清IL-6水平也明顯上升(P<0.05)，而第6，12，18周時與模型組比較，干預組血清IL-6水平均明顯下降(P<0. 05)，見圖3。

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖4 各組大鼠ALT、AST、GGT和ALP水平變化Note. Compared with the normal group，aP<0.05. Compared with the model group，bP<0.05.Figure 4 Changes of ALT, AST, GGT and ALP levels in the rats of each group

2.4 ATRA聯合OMT對大鼠肝功能的影響

第6、12、18周時與正常組比較，模型組、干預組大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP水平均明顯升高(P<0.05)；第12、18周時與模型組比較，干預組AST、GGT水平均明顯下降(P<0.05)，而第6、12、18周時與模型組比較，干預組ALT、ALP水平均明顯下降(P<0.05)，詳見圖4。

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖3 各組大鼠血清IL-6水平變化Note. Compared with the normal group, aP<0.05. Compared with the model group, bP<0.05.Figure 3 Changes of serum IL-6 levels in the rats of each group

2.5 ATRA聯合OMT對大鼠肝組織microRNA let-7a、NF-κB-p65、IL-6和STAT3 mRNA表達變化

第18周時，模型組大鼠肝組織microRNA let-7a表達量低于正常組 (P<0.05)，而干預組let-7a表達量明顯上升 (P<0.05)；同時正常組與模型組或干預組與模型組比較，大鼠肝組織中NF-κB-p65，IL-6，STAT3 mRNA表達量差異均有統計學意義 (P<0.05)，詳見圖5。

2.6 ATRA聯合OMT對大鼠肝組織STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖5 各組大鼠肝組織中microRNA let-7a、NF-κB-p65、IL-6，STAT3 mRNA表達變化Note. Compared with the normal group， aP<0.05. Compared with the model group， bP<0.05.Figure 5 Expression of microRNA let-7a, NF-κB-p65, IL-6 and STAT3 mRNA in the liver tissues of rats in each group

第18周時Western blot檢測結果：與正常組相比，模型組大鼠肝組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達均明顯上升(P<0.05)，而與模型組相比，干預組STAT3、p-STAT3蛋白表達均明顯下降 (P<0.05)，同時干預組p-STAT3蛋白表達較正常組也明顯下降(P<0.05)，見圖6。

3 討論

肝癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年全球范圍內約有69萬人死于肝癌，其中我國占約50%[7]。通常早期肝癌治療方式為手術，或經肝動脈插管化療栓塞、熱療、放療等，由于多數病人就診時已到中、晚期，此時病人肝功能和體質較差，很難耐受手術治療，多選擇接受化療，常用的藥物包括順鉑、苦參素等[8-10]。

氧化苦參堿是中藥苦參素的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗纖維化、免疫調節、抗炎鎮痛的作用。大量藥理研究證實，氧化苦參堿對胃癌、肝癌、直腸癌等細胞均具有較強的殺傷力[11]；全反式維甲酸在體內由維生素A轉化而來，是維生素A的一種重要活性代謝物，在癌細胞增殖，浸潤、轉移等各個階段來發揮其抑癌作用[12]。

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖6 各組大鼠肝組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達Note. Compared with the normal group，aP<0.05. Compared with the model group，bP<0.05.Figure 6 Expression of STAT3 and p-STAT3 proteins in liver tissues of the rats in each group

DEN對腫瘤的發生具有啟動和促進的雙重作用，具有重復性好、誘癌率高、操作簡便等優點，被廣泛運用在肝癌的研究中[13]。本實驗HE結果顯示，模型組明顯肝細胞異型性增生，多數增生肝細胞核仁普遍增大，出現核異質變以及癌變細胞，同時第18周時，模型組大鼠肝癌結節數較正常組顯著增多，這說明建模成功。

MicroRNA (miRNA) 是一類內源性小分子單鏈非編碼RNA，MiRNA參與調節多種癌癥的發生與發展，發揮負向調控基因表達的功能[14-15]。let-7a是目前研究最廣泛的miRNA之一，已被證實具有抑制腫瘤細胞增殖、促進分化和凋亡的功能。let-7a抑制肝癌細胞的生長主要是通過microRNA作用IL-6，Ras等基因表達來實現[16-17]；目前在肝癌與炎癥的關系中IL-6備受關注[18]，它參與多種細胞的增殖和分化、血細胞的生成及調節免疫反應。STAT3屬于胞漿蛋白家族，具有信號轉導、轉錄調控的雙重功能，同時STAT3是IL-6重要的調節因子，兩者相互作用，形成互相激活的通路。

本實驗主要考察DEN誘導肝癌中IL-6信號通路的作用，采用ATRA聯合OMT進行干預治療后檢測肝癌發生過程中IL-6通過STAT3連接NF-κB構成的炎癥-癌癥信號通路的改變[19-20]，同時觀察IL-6及其上游正調控基因NF-κB[20]和負調控基因1et-7a[21]的改變。HE染色的病理學觀察及肝功能檢測結果表明：干預組大鼠肝表面結節數，肝功能各指標水平明顯降低，這提示ATRA聯合OMT對DEN誘發的肝癌具有生長抑制作用，受損肝細胞數量減少；RT-qPCR實驗結果還顯示：不同階段干預組大鼠肝組織中IL-6、NF-κB-p65 mRNA表達水平低于模型組，而干預組microRNA let-7a表達量顯著高于模型組，這說明ATRA聯合OMT抑制IL-6 mRNA表達可能是通過上調microRNA let-7a mRNA表達和下調NF-κB-p65 mRNA表達來實現，從而阻斷IL-6信號通路活化。

Western blot結果顯示，干預組STAT3和p-STAT3蛋白表達均顯著低于模型組，提示ATRA聯合OMT干預治療能夠明顯抑制大鼠肝癌，其機制與下調NF-κB-p65的表達和上調let-7a表達，從而抑制靶基因IL-6的表達，以及阻斷IL-6/STAT3信號通路活化，進而抑制肝癌的發生和發展，起到防治肝癌的作用。