內皮型一氧化氮合成酶基因rs3918188位點多態性與漢族原發性高血壓的相關性

劉玲 林杰 李建民 王如珠

(泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300)

原發性高血壓(EH)是常見的慢性病，大量研究證實此類疾病與多種心腦血管疾病的發生有密切相關性〔1～3〕，隨著社會老齡化的加劇此類疾病的發病率也有所增加。EH的發病機制尚未闡明，目前主要認為受到遺傳、環境、生活習慣等因素的共同影響〔4〕。近年來隨著分子生物學研究的進步，EH的基因水平研究也取得了一定進展，研究顯示內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因是EH的重要候選基因〔5，6〕，但關于eNOS基因rs3918188位點的多態性與漢族EH患者的相關性尚未見報道。本文就eNOS基因rs3918188位點的多態性與漢族EH的相關性進行研究。

1 資料與方法

1.1臨床資料 研究對象選取2013年1月至2017年4月泰州市人民醫院收治的262例EH患者作為高血壓組、同期的260例健康體檢者作為對照組。高血壓組男140例、女122例，平均年齡(54.9±11.2)歲，均為漢族；對照組男139例、女121例，平均年齡(55.6±10.8)歲，均為漢族。EH患者符合2010年中國高血壓防治指南中的相關診斷標準〔7〕。兩組年齡、性別、民族等構成對比上差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2納入和排除標準 納入標準：①民族為漢族；②符合EH診斷(高血壓組)；③正在使用降壓藥物(高血壓組)；④知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①繼發性高血壓；②先天性心臟病、心瓣膜病、心肌病及肝腎功能不全者；③有內分泌病史者(對照組)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 兩組受檢者均禁食12 h，次日清晨空腹取外肘靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝，采用上海研生公司產DNA提取試劑盒提取DNA，采用美國Biotek公司產蛋白質核酸定量分析儀對DNA濃度進行測定，標化至30 ng/μl。

1.3.2基因分型 采用TaqMan法進行基因分型，儀器為ABI7300實時熒光定量PCR儀(美國Biotek公司)，建立10 μl反應體系，反應條件為：60℃下30 s，95℃下預變性10 min，95℃下15 s、60℃下60 s循環55次，60℃下30 s結束。采用SOS2.1軟件包處理基因分型結果，隨機抽取5%樣本進行復測。復測結果一致率100%。

1.3.3測序驗證 檢測美國生物技術信息數據庫中的單核苷酸多態性位點序列，采用Premier5.0軟件設計引物，由金斯瑞生物科技公司合成。eNOS測序引物上游序列：5′-CACGTAGA-GGATCTCAACTTCGTCC-3′，下游序列為5′-GTGAACTCCCAAGATA-GTCCTACT-3′。

1.4統計學方法 采用SPSS16.0軟件行χ2檢驗，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗樣本代表性。

2 結 果

2.1eNOS基因rs3918188位點基因型檢驗結果 eNOS基因rs3918188位點的擴增曲線見圖1。隨機從檢測結果中選取5%樣本進行復測，測序結果與PCR結果完全一致，見圖2。

2.2eNOS基因rs3918188位點基因型分布結果 高血壓組和對照組A/G基因型和等位基因頻率，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1 eNOS基因rs3918188位點RCR擴增圖

a：AA純合子，b：GG純合子，c：AG雜合子圖2 eNOS基因rs3918188位點測序結果

表1 兩組eNOS基因rs3918188位點基因型及等位基因頻率對比〔n(%)〕

3 討 論

EH是導致多種心腦血管疾病的病理基礎，近年來統計顯示成人高血壓發病率在25%以上〔8〕，EH的防治已經成為重點問題。漢族是我國最大的民族，人群遺傳背景相對復雜，但就同一個地區的人群進行研究，可一定程度上縮小環境、生活方式等因素的影響，將遺傳異質性控制在較小的范圍。eNOS基因與EH的相關性近年來被臨床重視，eNOS基因位于7號染色體q35～36區域，包含26個外顯子、26個內含子，對應mRNA可生成1 203個氨基酸產物，eNOS屬于一氧化氮限速酶，而一氧化氮在血壓調節和循環功能維持中有著重要的意義，如果eNOS基因發生改變，一氧化氮(NO)的合成就會出現障礙，導致患者血壓出現降低或升高，因此臨床認為eNOS基因屬于EH的重要候選基因〔9,10〕。

從目前國內外研究情況來看〔11〕，對于eNOS基因的研究主要集中于啟動子區的786位點、894位點及第4內含子的多態性上，且結論頗有爭議。本次研究選取的rs3918188位點基因位于第14內含子上。內含子在基因組中有著重要的基因調控作用，能夠通過自身剪接對基因表達產生影響，目前關于同屬于第14內含子的rs3918181位點研究較多，閆雪等〔12〕認為EH患者的rs3918181位點基因型頻率改變是導致發病的主要原因；方玲等〔13〕研究也顯示rs3918181位點上EH患者與健康體檢者的基因、等位基因頻率有顯著差異；但張旺德等〔14〕的研究顯示EH患者的rs3918181位點基因、等位基因頻率與健康體檢者對比無顯著差異。這說明目前關于EH基因多態性的研究尚存在爭議，考慮原因一方面與遺傳異質性有關，一方面則受到環境、生活方式等因素的影響。目前國內關于rs3918188位點的報道尚少，盧賢貴等〔15〕對新疆哈薩克族人群的eNOS基因rs3918188位點基因多態性進行了研究，結果顯示EH患者和健康體檢者對比eNOS基因rs3918188位點基因、等位基因頻率分布無顯著差異，且對eNOS基因rs3918188位點和rs7830位點的多態性進行了連鎖不平衡分析，結果顯示兩個位點間不存在連鎖不平衡，與本研究結論相符。本研究顯示漢族EH的發生可能與eNOS基因rs3918188位點多態性無明顯相關。本次僅選取漢族人群作為對象進行了研究，對于其他人群eNOS基因rs3918188位點多態性分布特點的研究尚存在空缺。此外，本研究樣本量相對較小，易產生統計偏差，尚需擴大樣本進一步證實。綜上所述，本次研究初步表明eNOS基因rs3918188位點多態性可能與漢族EH無明顯相關性。