小鼠β-防御素2對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響

李琰 李宇飛 丁恒一 劉濤 趙菊梅

(1南陽市醫學高等專科學校第一附屬醫院普通外科，河南 南陽 473000；2延安大學醫學院藥理學教研室)

結腸癌屬于臨床常見消化道腫瘤，其發病率、死亡率占據所有惡性腫瘤的第三位，且近年來發病率逐漸升高〔1〕，盡管近年來手術、放化療治療取得一定的臨床效果，但部分患者5年生存率不高，約為50%，因此探究其病理機制，對于尋找該病的治療靶點，提高患者的預后十分重要〔2〕。抗菌肽為生物體產生抵抗外界病原的小分子多肽，可抵抗病毒、真菌等，其主要活性成分為防御素。研究顯示當腫瘤細胞膜表面特性變化后能夠結合防御素，進而發揮抗腫瘤功效〔3〕。體外研究顯示小鼠β-防御素(mBD)2重組質粒能夠抑制宮頸癌細胞的增殖〔4〕。mBD2是否能夠影響結腸癌細胞的增殖，目前尚未有報道。本研究通過體外培養結腸癌細胞，并轉染mBD2重組質粒，以期探究其對結腸癌細胞增的影響及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1細胞與培養 人結腸癌細胞株SW480購于中國科學院上海細胞生物研究所，于-80℃冰箱中保存，使用時置于37℃溶解后，1 000 r/min離心5 min棄去上清，添加含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養基，37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2藥品與試劑 MTT、DMSO購于美國Sigma公司；RPMI1640培養基、胎牛血清、青霉素與鏈霉素均購于美國Gibco公司；胰酶溶液購于杭州碧云天生物研究所；Lipofectamine 2000試劑盒購于廣州Invitrogen公司；鼠抗人Bcl-2、Bax、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體購自美國Santa Cruz公司；鼠抗人β-actin抗體購美國CST公司；CCK8試劑盒、聚偏氟乙烯(PDVF)膜購于上海生工生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗購自美國R&D公司；蛋白提取試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo公司；AnnexinV-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡雙染試劑盒購自碧云天公司；電子熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；蛋白凝膠成像儀、酶標儀購自Bio-Red公司。

1.3實驗方法

1.3.1細胞處理 取對數期培養細胞，調整密度為5×105個/ml，制備單細胞懸浮液。構建重組質粒pcDNA3.1-mBD2，將細胞置于不含胎牛血清的培養液中培養1 h，參照Lipofectamine 2000轉染試劑盒進行轉染，轉染細胞分為3組，將轉染試劑、轉染空質粒pcDNA3.1、轉染重組質粒pcDNA3.1-mBD2分別轉染至SW480細胞，命名空白對照組(Control組)、陰性轉染組(NC組)、mBD2轉染組，轉染后置于37℃、5%CO2中培養48 h，隨后收集細胞上清，進行后續測定。

1.3.2CKK8法檢測細胞增殖情況 收集轉染后細胞接種于細胞培養孔中，細胞密度調整為1×105個/ml，每組設置6個重復孔，同時設定空白孔僅添加胞培養液，均放置37℃、5%CO2細胞培養箱內分別培養24 h、48 h、72 h、96 h，培養結束后加入CKK-8試劑，繼續培養2 h后，離心后保留下層細胞，每孔添加150 μl DMSO溶液，常溫孵育20 min，在酶標儀中570 nm處測定溶液吸光度OD值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(%)=(空白組OD-實驗組OD)/空白組OD×100%。

1.3.3細胞形態學觀察 細胞分組后繼續培養12 h，接種于含有蓋玻片6孔板內，過夜后，更換新鮮培養液繼續培養24 h，棄去上層細胞培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入10%甲醛溶液固定1 h，PBS清洗后，添加500 μl 1 μg/ml Hoechst33342 染液染色10 min，PBS沖洗后置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

1.3.4平板細胞克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數目 取對數生長期的各組細胞，0.25%胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，接種含37℃預溫培養皿內，放置37℃ 5% CO2細胞培養箱中培養10 d，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄去上清液，PBS清洗后添加4%多聚甲醛固定細胞，室溫下放置15 min，采用含0.1% Gimsa溶液染色30 min后，然后用流水緩慢洗去染色液，常溫下干燥，拍照后用肉眼直接計數細胞克隆形成數目。

1.3.5流式細胞術 將轉染后培養48 h的細胞中加入胰蛋白酶進行消化，調整細胞密度為1×106個/ml，用預冷PBS清洗2次后，加入70%乙醇溶液固定過夜，PBS清洗細胞后加入FITC-AV，避光下孵育20 min，與細胞流式儀中檢測細胞凋亡情況。收集轉染后培養48 h的細胞，添加200 μl PBS于75%乙醇冰上固定30 min。將細胞用0.05 mg/ml PI和0.5 mg/ml的RNA酶A孵育30 min后，置于流式細胞儀下檢測各時期DNA含量變化情況。

1.3.6Western印跡法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達情況 轉染后48 h，采用蛋白提取試劑盒各組SW480細胞總蛋白。采用BCA蛋白試劑盒對細胞中總蛋白含量進行測定。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離等量蛋白質，轉移至PDVF膜上，置于4℃下添加一抗與β-actin(1∶500)孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)常溫下孵育2 h。采用Tanon600圖像分析系統對Bcl-2、Bax、活化型caspase-3蛋白水平進行定量分析。

1.4統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1穩定轉染細胞株鑒定 轉染48 h后，流式細胞儀檢測轉染效率，結果顯示，轉染后結腸癌細胞株SW480發出綠色熒光，其轉染效率為85.39%以上，見圖1。

2.2CKK8法檢測細胞增殖情況 隨著細胞培養時間延長，mBD2轉染組細胞增殖抑制率逐漸升高，在同一時間點，與Control、NC組相比，mBD2轉染組細胞抑制率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3細胞形態學觀察 Hoechst染色顯示，Control、NC組細胞形態、大小均正常，mBD2轉染組細胞熒光強度增高，部分細胞出現碎片化。見圖2。

2.4細胞克隆形成情況 與Control組〔(72.44±13.58)個〕、NC組〔(76.53±12.16)個〕相比，mBD2轉染組〔(34.27±4.78)個〕細胞克隆形成數目均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 熒光顯微鏡檢測轉染情況(×200)

組別24 h48 h72 h96 hControl組6.36±0.876.49±0.796.93±0.887.01±0.71NC組6.57±0.926.66±0.896.75±1.026.89±0.84mBD2轉染組17.74±2.651)26.34±3.161)34.62±4.261)41.18±5.391)

與Control組、NC組比較：1)P<0.05，下表同

圖2 結腸癌細胞Hoechst染色(×100)

圖3 細胞克隆形成情況

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡情況 與Control組〔(5.46±1.07)%〕、NC組〔(4.95±1.03)%〕相比，mBD2轉染組細胞凋亡率〔(81.63±13.26)%〕升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.6細胞周期檢測 與Control、NC組相比，mBD2轉染組G1期DNA量均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。3組G2期、S期DNA量無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞周期變化

2.7細胞中Bax、Bcl-2、活化型caspase3蛋白表達情況 與Control、NC組相比，mBD2轉染組細胞中Bax、活化型caspase3蛋白表達均升高，Bcl-2蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 各組細胞中Bax、Bcl-2、活化型caspase3蛋白的表達

組別Bax/β-actinBcl-2/β-actin活化型caspase3/β-actinControl組0.23±0.030.93±0.170.36±0.04NC組0.25±0.040.88±0.040.39±0.05mBD2轉染組0.88±0.151)0.16±0.021)0.92±0.101)

3 討 論

結腸癌嚴重威脅人類健康，死亡率、發病率居高不下，因此尋找安全、高效的治療方法是目前的重要任務。臨床傳統治療主要以手術輔助放化療為主，但放化療副作用較大，患者難以忍受。近年來隨著分子生物學的發展，結腸癌基因治療獲得良好的進展，但安全問題及長期療效仍有待解決。腫瘤疫苗近期在結腸癌治療中取得了突破性進展，通過激活自身免疫系統增強機體抗癌能力，進而抑制腫瘤的增殖，降低腫瘤轉移、復發率〔5〕。防御素是產生免疫反應時自身細胞分泌的，具有抵抗細胞毒性、微生物的小分子多肽，在受到外界刺激時可即刻產生抗微生物反應，保護機體以免受到外界病原微生物損害，在固有免疫中發揮重要的調控作用，目前廣泛用于抗病毒、抗菌研究。近期研究顯示防御素可通過裂解腫瘤細胞，進而抑制腫瘤的增殖，提示防御素可能為腫瘤免疫治療的靶點〔6〕。

在BD防御家族中，mBD1為主要表達，其在腎臟、呼吸道黏膜上皮細胞中均表達。而mBD2、mBD3、mBD4在外界LPS及炎癥因子如IL-1、IL-17等誘導下激活NF-kB通路而表達。mBD2主要于呼吸道黏膜上皮中表達〔7〕。Zhang等〔8〕研究顯示mBD2可使小鼠對腫瘤抗原產生免疫應答反應進而抑制腫瘤的生長。在荷瘤模型小鼠中研究顯示mBD2能夠明顯抑制荷瘤小鼠腹水積累〔9〕。另外在宮頸癌中研究顯示其能夠抑制宮頸癌腫瘤的生長，抑制率可達40%〔10〕。Ping等〔11〕通過構建mBD2重組質粒并轉染至CT26腫瘤細胞，結果顯示BD2具有趨化DC的活性，腫瘤細胞生長受到抑制。本研究細胞轉染后穩定性較強，隨著培養時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸升高，表明mBD2對結腸癌細胞SW480具有一定的抑制作用。以往研究顯示mBD2可能通過影響腫瘤細胞呼吸，引發細胞代謝紊亂，進而降低其活性〔12〕，但具體機制還有待深入研究。

腫瘤的發生屬于周期性疾病，腫瘤細胞周期失控是導致細胞過度繁殖或腫瘤細胞生長抑制的主要原因。細胞周期主要由G1、S、G2期及分裂期M組成，其中G1期決定了細胞總周期的長短。越來越多證據表明，通過調控細胞周期有關蛋白進而對細胞周期進行調控，進而影響細胞體外增殖活性〔13〕。李海星等〔14〕研究顯示對人結腸癌細胞經吳茱萸堿處理后能夠使細胞周期阻滯在G1期，進而抑制結腸癌細胞的增殖，表明通過調控結腸癌的細胞周期，能夠明確藥物對結腸癌增殖影響的機制，可為結腸癌的臨床治療提供一定的參考。本研究表明mBD2能夠使細胞周期阻滯在G1期，引起細胞周期阻滯，從而參與調控結腸癌細胞的周期進展，發揮抑制腫瘤細胞增殖作用。

細胞凋亡時涉及一系列基因激活、表達，其中凋亡誘導因子和凋亡抑制因子占有重要作用〔15〕。caspase-3通路是機體正常發育過程中與細胞凋亡密切相關的決定性因素，能夠剪切凋亡過程較多關鍵蛋白進而在細胞增殖、分化、細胞凋亡過程中發揮著重要的調控作用〔16〕。另外Bcl-2家族也與細胞凋亡密切相關，正常情況下，Bax與Bcl-2和Bcl-xl形成二聚體阻止細胞凋亡；受到誘導凋亡刺激時，Bax蛋白表達增加，從細胞質中遷移至線粒體和核膜上，促使Bax-Bax二聚體在線粒體膜上形成，使線粒體膜通透性增加，使得凋亡誘導因子(AIF)、細胞色素C等凋亡因子進入細胞質中，激活caspase-3通路而誘發細胞凋亡〔17〕。在前列腺癌中研究顯示防御素能夠誘導凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9表達升高，誘導癌細胞凋亡，進而發揮抗腫瘤作用，表明防御素能夠誘導癌細胞凋亡，進而抑制腫瘤的增殖〔18〕。本研究結果表明mBD2可能通過調控Bcl-2/Bax表達，促進活化型caspase-3凋亡通路激活而實現對結腸癌細胞SW480凋亡的誘導作用，提示推測mBD2可能作為治療結腸癌的生物靶標。