穿心蓮內酯對IL-6誘導的非小細胞肺癌細胞侵襲轉移的影響及機制

楊金華 劉向前 趙天增

(南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院普胸外科，河南 南陽 473000)

穿心蓮內酯(AD)是傳統中藥穿心蓮的有效成分之一，被證實可通過抑制核因子(NF)-κB信號通路和基質金屬蛋白酶(MMP)-9發揮抗肺癌的作用，是一種有前途的抗肺癌候選藥物〔1〕。白細胞介素(IL)-6是一種癌癥相關炎癥因子，不僅介導腫瘤細胞的微環境，還可通過調控細胞的增殖、侵襲、轉移和血管生成等途徑促進腫瘤的發生發展〔2,3〕。上皮間質轉化(EMT)是使上皮細胞獲得運動能力進而引起癌細胞轉移的重要生物過程。已有研究〔4～6〕證實，IL-6可通過激活NF-κB信號通路促進EMT發生，增強肺癌細胞侵襲和轉移；AD可通過抑制促EMT細胞因子IL-6的表達抑制前列腺癌的進展，但其是否影響IL-6誘導的肺癌侵襲和轉移并不清楚。非小細胞肺癌是肺癌最常見的病理類型，約占肺癌的80%，而肺腺癌又占非小細胞肺癌的50%以上〔7〕。本研究旨在探討AD對IL-6誘導的A549細胞侵襲轉移的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 AD(純度≥95%)、二甲基亞砜、噻唑藍(MTT)試劑購于美國Sigma公司。RPMI1640培養基和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青公司。IL-6購于美國 BioVision公司。MMP-9抗體、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)抗體、IκBα抗體和β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。鈣黏蛋白E(E-cadherin)抗體和波形蛋白(Vimentin)抗體購于美國Bioworld公司。辣根過氧化酶標記的山羊抗兔/鼠免疫球蛋白(Ig)G購于美國Cell Signaling Technology公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司，ELX800酶標儀購于美國Bio-Tek公司。倒置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司，凝膠成像系統購于美國Bio-Rad公司，Transwell小室購于美國Millipore公司。細胞培養箱購于美國Thermo Scientific Heraeus公司。

1.2細胞來源及其培養 將來自上海生命科學院細胞資源中心的人肺腺癌細胞株A549在溫度為37℃、CO2體積分數為5%條件的細胞培養箱中以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基常規培養。

1.3細胞增殖 采用MTT法檢測AD對A549細胞增殖的影響。將生長良好的對數生長期的A549細胞以每孔200 μl(濃度106個/ml)平鋪于96孔細胞板上。置于細胞培養箱中培養過夜。將其分為9組，分別加入含有0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、30.0和50.0 μmol/L濃度AD的培養基120 μl，每組設置6個平行孔。作用24 h后，加入20 μl MTT溶液。反應4 h后，加入100 μl二甲基亞砜使結晶充分溶解。以酶標儀檢測各孔細胞在490 nm波長處的吸光度值。根據公式：細胞抑制率(%)=(1-藥物組吸光度值/對照組吸光度值)×100%計算各組細胞的抑制率。后期以20 μg/L、50 μg/L和100 μg/L濃度IL-6的作用于A549細胞，MTT法檢測IL-6對A549細胞增殖的影響，具體步驟同上。上述實驗重復3次。

1.4細胞侵襲實驗 將不同濃度AD處理后的A549細胞以0.25%胰蛋白酶消化后，加入無血清的培養基制成濃度為3×105個/ml的細胞懸液。以每孔100 μl加入到matrigel膠包被的Transwell小室的上室中。下室內，加入500 μl含10%胎牛血清的培養基。放入細胞培養箱中培養24 h后，從24孔細胞板中取出小室，以棉簽小心擦去小室上表面未穿過的細胞。采用甲醇和蘇木精-伊紅分別對小室下表面的細胞進行固定和染色。采用顯微鏡觀察統計侵襲細胞數。結果取隨機選取的6個視野內細胞數的均值。上述實驗重復3次。

1.5Western印跡檢測 參照總蛋白提取試劑盒步驟提取待測A549細胞的總蛋白后，采用BCA法對總蛋白的濃度及其純度進行檢測。取蛋白樣品50 μg加入到十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳通道孔中行電泳分離。采用濕式法轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉處理2 h。分別加入MMP-9抗體(1∶500)、E-cadherin抗體(1∶500)、Vimentin抗體(1∶800)、p-IκBα抗體(1∶500)、IκBα抗體(1∶500)和內參β-actin抗體(1∶1 000)孵育過夜。次日，經TBST溶液洗膜5 min×3次后，避光條件下滴加化學發光劑顯色曝光。采用Gel-Pro 3.1軟件進行分析。以目的條帶的灰度值/內參條帶的灰度值表示目的蛋白的相對表達水平。上述實驗重復3次。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、SNK-q及t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度的AD對A549細胞增殖的影響 以不同濃度的AD處理A549細胞24 h后，與0.0 μmol/L的抑制率〔(1.64±1.52)%〕比較，0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD對A549細胞的增殖無顯著影響〔(2.16±1.67)%、(4.16±2.23)%、(8.15±5.48)%，P>0.05〕，而5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、15.0 μmol/L、30.0 μmol/L和50.0 μmol/L濃度的AD能夠呈濃度依賴性抑制A549細胞增殖〔(18.31±2.11)%、(27.24±3.46)%、(48.92±4.93)%、(65.38±5.76)%、(73.59±7.07)%，F=130.315，P=0.000〕。

2.2不同濃度IL-6對A549細胞增殖的影響 與0 μg/L抑制率〔(2.80±1.54)%〕比較，20 μg/L、50 μg/L和100 μg/L IL-6處理A549細胞24 h后，IL-6對A549細胞增殖無顯著影響〔(5.14±2.68)%、(8.31±4.76)%、(6.21±3.80)%，F=1.352，P=0.325〕。后續選用低濃度(20 μg/L)的IL-6進行實驗。

2.3AD對IL-6誘導的A549細胞侵襲的影響 給予20 μg/L濃度的IL-6處理后，A549細胞的侵襲能力較對照組明顯增強(126.37±11.45 vs 48.35±6.72,P<0.05)。然而，給予0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD處理后，IL-6對A549細胞侵襲的促進作用明顯受到抑制(101.55±8.72、40.62±6.34、36.72±4.94 vs 126.37±11.45，P<0.05)，且呈現一定的濃度依賴性。見圖1。

圖1 Transwell小室檢測各組A549細胞的侵襲結果(×200)

2.4AD對IL-6誘導A549細胞EMT的影響 采用Western印跡進一步檢測AD對IL-6誘導的EMT的影響。結果發現，IL-6刺激能夠明顯降低A549細胞中E-cadherin蛋白的表達，而升高Vimentin蛋白的表達；而以0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD作用后，IL-6對A549細胞上述作用明顯減弱，且呈一定的濃度依賴性。見圖2和表1。

1～5：對照組、IL-6組、0.5 mol/L AD+IL-6組、1.0 mol/L AD+IL-6組、3.0 mol/L AD+IL-6組，下圖同圖2 Western印跡檢測A549細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的表達

組別E-cadherinVimentin對照組2.34±0.160.17±0.03IL-6組 1.00±0.081)1.00±0.061)0.5 μmol/L AD + IL-6組1.27±0.112)0.83±0.052)1.0 μmol/L AD + IL-6組1.59±0.132)3)0.60±0.062)3)3.0 μmol/L AD + IL-6組1.75±0.152)3)0.55±0.052)3)F/P值46.644/0.000104.141/0.000

與對照組相比較：1)P<0.05；與IL-6組比較：2)P<0.05；與0.5 μmol/L AD+ IL-6組相比較：3)P<0.05

2.5AD對IL-6誘導A549細胞NF-κB通路活化的影響 為了探討AD對IL-6誘導A549細胞侵襲轉移的分子機制，采用Western印跡進一步檢測A549細胞中NF-κB通路相關蛋白的表達變化。結果發現，IL-6刺激后，A549細胞中p-IκBα蛋白表達升高，而IκBα蛋白表達降低，NF-κB信號通路激活；而0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L AD能夠呈濃度依賴性明顯抑制IL-6對549細胞中NF-κB通路的活化。見圖3和表2。

圖3 Western印跡檢測A549細胞中NF-κB通路相關蛋白的表達

組別p-IκBαIκBα對照組0.13±0.021.55±0.06IL-6組1.00±0.081)1.00±0.091)0.5 μmol/L AD + IL-6組0.83±0.072)1.23±0.072)1.0 μmol/L AD + IL-6組0.62±0.062)3)1.56±0.042)3)3.0 μmol/L AD + IL-6組0.24±0.042)3)4)2.15±0.022)3)4)F/P值123.666/0.000151.508/0.000

與對照組相比較：1)P<0.05；與IL-6組比較：2)P<0.05；與0.5 μmol/L AD+ IL-6組比較：3)P<0.05；與1.0 μmol/L AD+ IL-6組比較：4)P<0.05

2.6AD對IL-6誘導的A549細胞轉移相關蛋白MMP-9的影響 給予IL-6處理后，A549細胞中MMP-9蛋白的表達水平較對照組明顯升高(1.03±0.11 vs 0.68±0.08,P<0.05)；而給予0.5、1.0和3.0 μmol/L AD作用后，IL-6對MMP-9蛋白表達的促進作用明顯減弱(0.73±0.08、0.55±0.05、0.47±0.04 vs 1.03±0.11，P<0.05)，且呈一定的濃度依賴性。見圖4。

圖4 Western印跡檢測MMP-9蛋白表達

3 討 論

IL-6可協調輔助性T細胞(Th)17型細胞因子、TNF-α激活細胞信號轉導與轉錄激活因子(STAT)3和NF-κB促進結直腸癌細胞的生長〔8〕。骨髓中高表達的IL-6可通過MMP-9促進胰腺癌的侵襲性生長和轉移〔9〕；IL-6可激活酪氨酸激酶(JAK)2/STAT3信號通路促進胃癌EMT和癌細胞轉移，抑制其表達可改善腫瘤腹膜轉移〔10〕。IL-6與肺癌的發生發展關系密切，在癌細胞的侵襲轉移過程中發揮著重要作用〔11〕。IL-6在非小細胞肺癌組織中高表達，與腺癌組織類型相關〔12〕。本研究結果與姜伊娜〔4〕研究發現的IL-6可通過激活毛細血管擴張共濟失調突變基因(ATM)-NF-κB通路促進EMT的發生，增強肺癌細胞遷移的分子機制部分吻合。NF-κB信號通路是一條公認的炎癥信號通路，也是細胞內重要的核轉錄因子，IκBα是NF-κB的抑制蛋白；一般情況下以無活性的三聚體復合物p65/p50/IκBα形式存在，但當細胞受到炎癥因子等刺激時，IκBα磷酸化降解釋放p65/p50二聚體進入細胞核，激活下游相關基因，進而參與調控細胞增殖、侵襲、炎癥反應和免疫應答等過程〔13，14〕。細胞外基質的降解是腫瘤細胞發生轉移的重要病理過程，而MMPs蛋白家族在該過程中發揮著重要作用；MMP9是MMPs家族成員，也是NF-κB信號通路下游相關基因，在肺癌的侵襲轉移密切相關〔15，16〕。可見，IL-6刺激可通過激活NF-κB信號通路增強了A549細胞的侵襲轉移能力。

AD是從穿心蓮中提取的一種二萜內酯類化合物，具有抗炎、抗腫瘤和抗心血管疾病等藥理活性〔17，18〕；而近年來隨著中藥抗腫瘤研究的熱潮，AD抗腫瘤的作用備受關注。研究〔19，20〕發現，AD不僅可通過Toll樣受體(TLR)4/NF-κB/MMP-9信號通路抑制人結腸癌SW620細胞增殖；還可通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路抑制卵巢癌SKOV-3細胞的活力與侵襲能力，并增強細胞的凋亡能力。AD可通過抑制腫瘤細胞活性、癌細胞侵襲轉移、生長因子信號傳導和誘導細胞凋亡等機制發揮抗腫瘤作用，是一種潛力巨大的新型抗腫瘤藥物。近年來有研究〔6〕指出，AD可通過抑制促EMT的細胞因子IL-6的表達抑制前列腺癌進展，但其是否通過這一機制改善非小細胞肺癌的侵襲轉移過程尚未可知。本研究提示，AD可通過抑制NF-κB信號通路的活化抑制IL-6誘導的非小細胞肺癌細胞的侵襲轉移。