類固醇激素受體起始密碼子區(qū)突變位點報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建

畢紅東 李寶群 萬立野

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

類固醇激素受體(VDR)是核轉(zhuǎn)錄因子的一種，屬于/甲狀腺激素受體超家族的成員。1，25(OH)2D3與VDR結(jié)合為激素受體復(fù)合物后能夠調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞分化與抑制增殖〔1〕；調(diào)控藥物代謝酶及內(nèi)外源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運體等〔2〕。近年來針對VDR在內(nèi)的類固醇激素受體基因突變的研究逐漸成為熱點〔3〕。野生型VDR編碼的蛋白質(zhì)含有427個氨基酸，起始密碼子區(qū)突變造成ATG中的(T)變異為(C)后導(dǎo)致突變型蛋白質(zhì)變?yōu)?24個氨基酸，體外研究顯示將攜帶VDR的cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系COS-7后發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞表達VDR mRNA，并且生長與其特異性配體骨化三醇的劑量相關(guān)，表明1，25(OH)2D3抗腫瘤作用是通過受體VDR介導(dǎo)〔4〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)患者攜帶VDR基因型不同則腫瘤易患性也不同〔5〕；目前對VDR基因翻譯起始密碼子變異的研究多集中在突變與疾病發(fā)生方面，并未對具體調(diào)控做系統(tǒng)的分析。本研究利用分子遺傳學(xué)技術(shù)，通過構(gòu)建報告基因載體，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染來驗證其表達活性，為進一步深入研究該基因提供體外平臺。

1 材料和方法

1.1材料 Trizol 試劑(Hyclone)，質(zhì)粒小量提取試劑盒和質(zhì)粒DNA大量制備試劑盒以及DNA 膠回收試劑盒(Qiagen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，T4 DNA連接酶，T4 PNK RT-PCR 試劑盒，GeneRuler 100 bp DNA Ladder購自MBI公司，EcoRⅠ內(nèi)切酶，XhoⅠ內(nèi)切酶HindⅢ 內(nèi)切酶，STAR HS DNA聚合酶、5倍緩沖液dNTP DNA JM109菌種(TIANGEN)；普通瓊脂糖、低熔點瓊脂糖，氨芐青霉素，酵母，F(xiàn)BS，LB液體培養(yǎng)基均購自TaKaRa公司，COS-7細(xì)胞株(上海細(xì)胞所)，載體pcDNA3.1(-)B-myc/his，PGEM-T載體，pGL3-promoter載體內(nèi)切酶和聚合酶購自TaKaRa公司；Dual-Luciferase Reporter Assay system和DMEM和血清購自Invitrogen公司，PCR引物合成由上海博亞公司。

1.2方法

1.2.1人VDR基因克隆 Trizol法制備總RNA，野生型所用引物：5′-tagaattctggaggcaatggcggc-3′和5′-actaagctttctcattgccaaacacttc-3′；突變體所用的引物為5′-tagaattcgtggcggccagcacttc-3′和5′-actaagcttgtcattgccaaacacttc-3′將肝臟組織(承德醫(yī)學(xué)院生物標(biāo)本庫)在液氮中磨碎，Trizol法制備。PCR體系和條件：產(chǎn)物2.5 μl，dNTP 1.5 μl，5×緩沖液5 μl，前引物0.5 μl，后引物 0.5 μl，0.5 μl聚合酶，混勻后上樣置于PCR儀，參數(shù)設(shè)定為94 ℃10 min開始，然后55℃15 s，而后72 ℃90 s，一共35 個循環(huán)，最后再次72℃10 min。將T4 DNA連接酶與PGEM-T克隆載體將cDNA目的片段進行連接。

1.2.2野生型和起始密碼子區(qū)突變VDR真核表達載體的構(gòu)建 VDR目的片段(約1.3 kb)純化后從T克隆載體上消化后與表達載體pcDNA3.1(-)B-myc/his連接，連接體系如下：緩沖液1 μl，T4連接酶1 μl，PCR 產(chǎn)物5 μl補水至10 μl，產(chǎn)物與載體比例為1∶4，混勻離心后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，初步鑒定采用酶切電泳，最終鑒定采用測序(上海英駿生物公司)。野生型載體人VDR構(gòu)建成功后以其為模板引入突變位點引物進行PCR擴增，按同樣方法將擴增后產(chǎn)物與表達載體pcDNA3.1-myc/his B(-)連接，測序驗證命名為人VDR起始密碼子區(qū)突變型(圖1)。

圖1 真核表達載體pcDNA3.1(-)B-myc/his/人VDR

1.2.3轉(zhuǎn)染處理 DMEM+10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)COS-7，在37 ℃和CO2為5%的條件下，當(dāng)細(xì)胞匯合生長到80%時傳代接種至96 孔培養(yǎng)板上。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制的轉(zhuǎn)染試液，海腎熒光素酶報告質(zhì)粒用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，平行6 個孔，每個樣品至少重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染實驗分為兩組，一組為野生型載體組，另一組為突變體VDR，以phRL-SV40報告載體作為內(nèi)對照；空載體pcDNA3.1(-)B-myc/his為空白對照；各待檢載體進行共轉(zhuǎn)染及藥物處理。

1.2.4雙熒光素酶活性分析 報告基因試劑處理30 h后，細(xì)胞用PBS洗滌1次，加入裂解液裂解細(xì)胞，在檢測管中加入藥物1，25(OH)2VD3，對照phRL-SV40和Lip 2000混勻后放置于檢測孔中測定熒光素酶活力。

1.3統(tǒng)計處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1真核表達載體人核受體野生型VDR的構(gòu)建 VDR全長擴增應(yīng)用RT-PCR方法，VDR cDNA為427個氨基酸(約1.3 kb)，擴增產(chǎn)物片段與理論相符，擴增產(chǎn)物和載體分別用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后進行連接形成重組載體pcDNA3.1(-)B-myc/his/人VDR(圖1和圖2)，提質(zhì)粒再次行上述兩種酶切檢測并同時測序，GenBank序列分析表明，酶切片段長度與插入片段和目的片段長度序列方向完全一致，核受體VDR mRNA編碼區(qū)已重組到表達載體中(見圖3，圖4)。

泳道1：Ladder(3 kb)；2～6泳道：重組VDR雙酶切后的片段〔目的片段1.3 kb，空載體 PC-DNA3.1(+)/-his 5.5 kb〕；2與6泳道：野生型；3～5泳道：突變體圖2 重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)B-myc/his/h VDR(野生型與突變型)酶切結(jié)果

圖3 野生型人VDR測序分析

圖4 突變型人VDR測序分析

2.2真核表達載體人核受體VDR突變型的構(gòu)建 以野生型人VDR質(zhì)粒菌液作模板，根據(jù)CDR起始密碼子區(qū)T/C突變設(shè)計相應(yīng)引物(與野生型相比丟失3個氨基酸也就是9個堿基)，所以片段長度基本不變(1.3 kb)，PCR擴增hVDR突變?nèi)LcDNA其余方法同構(gòu)建野生型載體。同樣用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切檢測(圖2)。挑選陽性克隆進行測序然后進行質(zhì)粒大量抽提做細(xì)胞轉(zhuǎn)染備用。

2.3熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建 通過共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VDR-和pGL3-VDR-luc及內(nèi)對照質(zhì)粒pRL-SV40 建立的 VDR報告基因體系，隨著特異性配體濃度的增加熒光素酶表達量也隨之增加，轉(zhuǎn)染野生型和突變體的VDR質(zhì)粒載體在3個1，25(OH)2VD3濃度組，代表VDR轉(zhuǎn)錄活性的熒光素酶比活性值與溶媒對照及空載體對照有顯著差異，轉(zhuǎn)染突變體組mRNA水平的轉(zhuǎn)錄激活能力高于轉(zhuǎn)染野生型組(圖5)。

圖5 各處理組熒光素酶比活性值的比較

3 討 論

真核表達載體pcDNA3.1(-)B-myc/his大小為5.5 kb，攜帶有多克隆酶切位點和巨細(xì)胞病毒(pcMV)加強型啟動子合并含有抗新霉素基因，許多哺乳動物真核細(xì)胞都可以高效表達，因此應(yīng)用pcDNA3.1(-)B-myc/his作為表達載體可為研究目的基因表達奠定良好的實驗基礎(chǔ)；另外我們以PGEM-T作為克隆載體，主要是因為T連時只做單酶切不用做方向性選擇，操作簡單及連接效率較高。而且pcDNA3.1(-)B-myc/his(空)大小為5.5 kb，PGEM-T本身僅3 kb長，如果做定點突變那么空載體略顯過長會導(dǎo)致誘變效率低下。本模型采用熒光素酶檢測表達載體轉(zhuǎn)錄活性是基于以下幾點：熒光素酶檢測及其靈敏且速度很快在幾秒鐘內(nèi)可以完成兩種熒光素酶的測定，不但方便而且可避免放射性物質(zhì)；同時上樣無需預(yù)處理且對內(nèi)源背景要求較低，高通量藥物篩選選用次方法最為適用；線性范圍分析數(shù)量級可達10個左右，微量細(xì)胞裂解物即可滿足實驗所需；大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)還可在細(xì)胞96孔板進行，報告基因分析也會受轉(zhuǎn)染效率或細(xì)胞活性等因素影響，為此我們設(shè)立了啟動子轉(zhuǎn)錄的海腎熒光素酶作為內(nèi)對照報告基因與實驗報告基因共轉(zhuǎn)染的方法以降低細(xì)胞數(shù)目、狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄和裂解效率等原因造成的誤差，從而使得結(jié)果更加準(zhǔn)確。有關(guān)類固醇激素受體VDR對下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究近來日益受到重視。體外細(xì)胞水平已經(jīng)證實1，25(OH)2D3通過受體VDR調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄表達，而受體被iRNA干擾后其誘導(dǎo)作用幾乎消失〔6〕。在美國黑人、白人、新加坡人的研究中分別發(fā)現(xiàn)起始密碼子區(qū)突變者結(jié)腸腫瘤易患性比野生型和雜合子基因型者顯著降低〔7〕。但是此位點突變與腫瘤發(fā)生是否存在關(guān)聯(lián)及其機制目前缺乏相關(guān)的研究，本實驗構(gòu)建了含有人類固醇激素受體VDR起始密碼子突變的報告基因系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)染COS-7 細(xì)胞驗證了VDR具有轉(zhuǎn)錄活性，為揭示受體在疾病發(fā)生反應(yīng)差異的遺傳機制和證實遺傳變異對疾病發(fā)生發(fā)展的影響起決定作用的分子機制初步搭建了一個體外實驗平臺。